Культивирование и индикация вирусов

Культивирование вирусов человека проводят с целью лабораторной диагностики вирусных инфекций, для изучения вопросов патогенеза и иммунитета, для получения диагностических и вакцинных препаратов.

Для культивирования вирусов используют лабораторных животных, развивающиеся куриные эмбрионы, культуры клеток.

Лабораторных животных разными способами заражают (учитывают тропизм вирусов: ортомиксовирусами заражают интраназально, нейровирусами – субдурально). На основании типичных признаков заболевания и патоморфологических изменений органов животных можно судить о репродукции вирусов, т.е. проводить индикацию вирусов.

Куриный эмбрион является удобной моделью для культивирования вирусов, т.к. полости его стерильны, защищены твердой оболочкой. Индикацию вируса в курином эмбрионе проводят: по гибели эмбриона; помутнению хорион-аллантоисной оболочки; образованию бляшек на оболочке; в реакции гемагглютинации (происходит склеивание эритроцитов под действием гемагглютинина вирусов, который расположен в шипах суперкапсида).

Метод культур клеток. Для приготовления культур клеток используют различные ткани человека и животных. Чаще применяют культуры клеток из эмбриональных (куриные фибробласты, человеческие фибробласты) и опухолевых (злокачественно перерожденных) тканей, обладающих активной способностью к росту и размножению.

Различают три типа культур клеток: однослойные культуры клеток; культуры суспензированных клеток; органные культуры.

Однослойные культуры клеток по числу жизнеспособных генераций разделяют на первичные или первично трипсинизированные (куриные и человеческие фибробласты); перевиваемые (способны размножаться в лабораторных условиях длительное время); полуперевиваемые диплоидные (способны размножаться в течение 40-50 пассажей).

Для культивирования клеток необходимы питательные среды, которые по своему назначению делятся на ростовые и поддерживающие. В составе ростовых питательных сред должно содержаться больше питательных веществ, чтобы обеспечить активное размножение клеток для формирования монослоя. Поддерживающие среды должны обеспечивать лишь переживание клеток в уже сформированном монослое при размножении в клетке вирусов.

Широкое применение находят стандартные синтетические среды, например, синтетическая среда 199 и среда Игла. Независимо от назначения все питательные среды для культур клеток конструируются на основе сбалансированного солевого раствора. Чаще всего им является раствор Хенкса. Неотъемлемый компонент большинства ростовых сред – наличие 5-10 % сыворотки крови животных (телячьей, бычей, лошадиной), без наличия которой размножение клеток и формирование монослоя не происходит. В состав поддерживающих сред сыворотка не входит.

Культуры суспензированных клеток растут и размножаются во взвешенном состоянии при постоянном интенсивном перемешивании среды. Они используются для накопления вирусов.

Некоторые вирусы размножаются в органных культурах – это кусочки органов, выращенные вне организма и сохраняющие структуру данного органа.

О размножении вируса в культуре клеток судят по следующим признакам: цитопатогенному действию (ЦПД); образованию в клетках включений; появлению бляшек; феномену гемадсорбции; цветной пробе.

Цитопатогенное действие может проявляться полной дегенерацией клеток – слущиванием клеток с поверхности стекла после их гибели (энтеровирусы полиомиелита, Коксаки); частичной дегенерацией – округлением клеток, слиянием и образованием симпластов (вирус кори).

Образование включений в клетках – это скопление вирионов или отдельных компонентов в цитоплазме или в ядре клеток, выявляемые под микроскопом при специальном окрашивании. Вирус натуральной оспы образует цитоплазматические включения – тельца гварниери, вирусы герпеса, аденовирусы – внутриядерные включения.

Появление бляшек – зоны клеток, разрушенных вирусом (негативные колонии вирусов), обнаруживают в клеточных культурах, растущих на стекле и покрытых тонким слоем агара. Бляшки различаются по величине, форме, времени появления, поэтому данный тест используют для дифференциации вирусов.

Реакция гемадсорбции заключается в способности клеток, зараженных вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроциты, потому что эти клетки несут на поверхности гемагглютинины вируса.

Цветная реакция основана на изменении цвета питательной среды с индикатором, используемой для культур клеток. При росте клеток, не пораженных вирусом, идет накопление продуктов метоболизма, которые изменяют цвет питательной среды. При репродукции вирусов в культуре нарушается метаболизм клеток, и среда сохраняет первоначальный цвет.

При отсутствии ЦПД можно поставить реакцию интерференйии – исследуемая культура повторно заражается вирусом, вызывающим ЦПД. В положительном случае ЦПД будет отсутствовать (реакция интерференции положительная), если в исследуемом материале вируса не было, наблюдается ЦПД.

Лабораторная диагностика вирусных инфекций.Используют методы экспресс-диагностики для обнаружения возбудителя или его антигенов в клиническом материале (ИФА, РИА, метод молекулярной гибридизации, ИФА, ПЦР, ВИЭФ, РПГА, электронной микроскопии, иммуно электронной микроскопии).

Выделение вируса и его индикацию и идентификацию проводят в вирусологическом методе диагностики. С этой целью необходимо обеспечить взятие материла от больного, правильную транспортировку его в лабораторию и грамотного заполнения сопроводительных документов. Выделение вируса из клинического материала проводят путем заражения культур клеток куриных эмбрионов и лабораторных животных. Индикацию вирусов проводят по гибели эмбрионов, постановке РГА, ЦПД в культуре клеток.

Идентификацию вирусов проводят с помощью серологических методов (постановки РТГА, РСК, ИФА, РИА, РН). Серологическая диагностика вирусных инфекций проводится с парными сыворотками больного, взятыми в острой фазе заболевания и через 10-14 дней. Обнаружение четырехкратного и более повышения титра антител рассматривается как диагностический признак острой вирусной инфекции.

Принципы химиотерапии и химипрофилактики вирусных инфекций.Мишенью действия противовирусных препаратов являются процессы адсорбции, проникновения вируса в клетку, депротеинизации, транскрипции, репликации и сборки вирусов.

1. Аномальные нуклеозиды ингибируют функции вирусных полимераз (иоддезоксиуредин, ацикловир при лечении герпеса).

2. Производные адамантамина гидрохлорида. Ремантадин ингибирует репролукцию вирусов гриппа, кори, краснухи

3. Тиосемикарбазон подавляет синтез вирусных белков и сборки вирусных частиц, активен против вирусов натуральной оспы.

4. Ингибиторы протеаз (гордокс, контрикал, аминокапроновая кислота).

5. Нарушают синтез вирусных белков – интерфероны.

4.5. Бактериофаги

Бактериофаги (от бактерий и греч, рhagos-пожиратель) – вирусы бактерий, обладающие способностью специфически проникать в бактериальные клетки, репродуцироваться в них и вызывать их лизис. Они не размножаются в эукариотических клетках.

В 1910 г. Ф. д’Эрелль обнаружил лизис бактерий дизентерии после добавления к ним бесклеточного фильтрата испражнений больных дизентерией и назвал фактор лизиса бактериофагом.

Бактериофаги широко распространены в природе, их обнаруживают в воде, почве, пищевых продукта, в различных выделениях из организма человека и животных.

Морфология. Большинство фагов под электронным микроскопом напоминают по форме головастика или сперматозоида; имеют головку и отросток (рис. 8), но встречаются и другие морфологические варианты. Размеры фагов – 20-200 нм. Выделяют пять основных типов бактериофагов. К 1 типу относятся ДНК-овые фаги нитевидной формы, которые лизируют бактерии, содержащие F- или R-плазмиду; II тип – РНК-содержащие фаги с рудиментом отростка; III тип – фаги ТЗ, Т7 с коротким отростком; IV тип – фаги с несокращающимся чехлом отростка и двунитевой ДНК (Т1, Т5 и др.); V тип – ДНК-содержащие фаги с сокращающимся чехлом отростка, который заканчивается базальной пластинкой. Наиболее изучены Т-фаги (англ. type – типовые) E.coli – группа коли-дизентерийных фагов, включающая 7 представителей Т1-Т7.

Структура. Фаги имеют нуклеиновую кислоту (ДНК или РНК) и белок. Двунитевая ДНК фагов замкнута в кольцо и упакована в головке. Некоторые фаги содержат однонитевую ДНК или РНК. Капсид головки фага образован белками по кубическому типу симметрии.

В частицах некоторых фагов под чехлом дистальной части отростка (фаг T2) содержится фермент лизоцим, АТФ-аза и ионы кальция. Внутри головки (фаг T2) имеется внутренний белок, связанный с нуклеиновой кислотой, который содержит полиамины (спермин, путресцин). Он обеспечивает суперспирализацию фаговой ДНК и ее упаковку в головке фага. Отросток (хвост) фага имеет полый белковый стержень (построен по типу спиральной симметрии), покрытый сократительным чехлом. Белки чехла связаны с молекулами АТФ и ионами кальция. Чехол способен сокращаться. Под чехлом в конце отростка может находиться лизоцим. Отросток обычно заканчивается базальной пластинкой, имеющей короткие зубцы, от которых отходят тонкие нити – структуры, обеспечивающие адсорбцию фага на бактерии.

Резистентность к факторам окружающей среды. Фаги более устойчивы к действую физических и химических факторов, чем бактерии и вирусы. Они выдерживают давление до 6 000 атм, сохраняют свою активность при рН от 2,5 до 8; не все дезинфицирующие вещества (0,5% раствор фенола, 1% раствора сулемы, этиловый спирт, эфир, хлороформ) разрушают фаги. Однако ультрафиолетовые лучи и ионизирующая радиация, 1% раствор формалина, температура 65-70°С инактивируют их. Они сохраняются длительное время при высушивании в запаянных ампулах, замораживании, в глицерине при температуре 185°С.

Антигенные свойства. Бактериофаги обладают иммуногенными свойствами, вызывают синтез антител (AT), которые не дают перекрестных реакций с антигенами (АГ) бактерий, инфицированных фагами. Для идентификации фагов применяют реакцию нейтрализации с гомологичной антисывороткой, реакцию преципитации, реакцию агглютинации. По антигенам фаги делятся на серотипы.

Взаимодействие фагов с бактерией включает несколько стадий.

Адсорбция фагов на бактерии осуществляется рецепторами фага, имеющимися на конце отростка, которые связываются с поверхностными структурами бактериальной стенки. Бактериофаги не адсорбируются на бактериях, лишенных клеточной стенки (протопластах). Некоторые фаги адсорбируются на F-пилях бактерий. Адсорбция фагов зависит от рН среды, температуры, наличия некоторых веществ (триптофана для Т2-фага). На одной клетке может адсорбироваться до 300 фагов.

Внедрение нуклеиновой кислоты фага (инъекция фага). Базальная пластина отростка и его лизоцим лизируют участок клеточной стенки бактерии. Одновременно в чехле высвобождаются ионы кальция, активирующие АТФ-азу, происходит сокращение чехла и вталкивание стержня отростка через мембрану в бактерию. При этом фаговая ДНК (РНК) через стержень впрыскивается в цитоплазму клетки, белки головки и отростка остаются снаружи.

Репродукция фага. Проникнув в клетку ДНК фага переходит в латентное состояние (скрытая – эклипс-фаза). В этот период она подавляет синтетические клеточные процессы клетки и индуцирует синтез фаговых белков.

Синтез фаговых белков. Бактериальная РНК-полимераза транскрибирует фаговую ДНК в мРНК, по которой в рибосомах синтезируются ранние белки фага и его РНК-полимераза. Последняя обеспечивает транскрипцию поздних белков оболочки..

Репликацию фаговой нуклеиновой кислоты осуществляют синтезированные в клетке ДНК-полимеразы. ДНКбактерии нередко расщепляется и служит материалом для синтеза нуклеиновой кислоты фага.

Сборка фаговых частиц заключается в заполнении фаговой ДНК пустотелых капсид головки. Весь процесс осуществляется за 40 минут. Выход зрелых фагов обычно происходит путем лизиса бактериальной клетки. Лизис чаще всего осуществляется фаговым лизоцимом. Фаги, лизировавшие бактерии, называют вирулентными и они могут находиться в двух состояниях: 1) в виде зрелого фага – метаболически инертного, существующего вне клетки, и 2) вегетативного, который размножается в клетке и вызывает «продуктивную» инфекцию у бактерий. Некоторые ДНК-содержащие фаги (фаг fd) выходят из клетки путем «просачивания» ДНК через цитоплазматическую мембрану и клеточную стенку бактерии, где упаковываются в капсиды.

Взаимодействие фагов с бактериальной клеткой характеризуются высокой специфичностью. Моновалентные фаги взаимодействуют только с бактериями определенного вида, а типовые фаги – только с отдельными вариантами (типами) данного вида бактерий. Типоспецифические бактериофаги используют для выявления соответствующих бактерий – т.е. для их фаготипирования. Поливалентные фаги могут взаимодействовать с родственными видами бактерий.

Умеренные фаги и лизогения.Взаимодействие фага с клеткой иногда ведет к интеграции его генома в геном бактерии. Фаги, вызывающие данный тип взаимодействия, называют умеренными. ДНК умеренного фага встраивается в ДНК бактерии и такой фаг называют профагом. Таким образом, умеренные фаги бывают в трех состояниях: зрелый фаг, вегетативный фаг и профаг. Профаг, ставший частью хромосомы бактерии, при ее размножении реплицируется синхронно с ее геномом, но не вызывает бактериолизиса, а передается по наследству от клетки к клетке неограниченному числу потомков.

Явление интеграции генома бактерии с умеренным фагом в состоянии профага называется лизогенией, а бактерии, несущие профаг – лизогенными. Бактериальная клетка, несущая в себе профаг, становится резистентной к действию идентичного фага. В клетке вырабатываются репрессоры – белки генома профага, препятствующие его размножению и проникновению в клетку идентичных фагов. Связь генома профага и бактерии непостоянна и под действием ультрафиолетовых лучей, радиации, некоторых химических веществ возможно образование зрелых форм фага и лизис бактерии. Эти фаги, бывшие профагами, могут со своей ДНК переносить группы генов бактерии в другую бактерию, в которой они снова переходят в профаг. Бактерия, зараженная таким фагом, приобретает новые свойства за счет генов предыдущей бактерии, перенесенных дефектным фагом. Изменение свойств микроорганизмов под влиянием профага обозначается как фаговая лизогенная конверсия. Она может происходить у многих видов микроорганизмов и сопровождается изменением их различных свойств: культуральных, биохимических, антигенных, токсигенных, чувствительности к антибиотикам. Причиной ее может быть наряду с переносом генов других бактерий с помощью фага, также активация молчащих генов бактерий, когда гены профага выступают в роли промоторов.

Явление переноса генов бактерий умеренными фагами называют трансдукцией. Эти фаги обычно неспособны образовывать фаговое потомство, если в их нуклеиновую кислоту встроилась часть нуклеиновой кислоты бактериальной клетки. Трансдуцирующие фаги используют в качестве векторов (переносчиков) в генной инженерии. С их помощью в бактерии переносят гены человеческих клеток, синтезирующие гормоны, цитокины и др.

Получение фагов. Для получения вирулентного фага готовят фильтрат исходного материала (вода, фильтрованная суспензия фекалий и др.), пропуская его через бактериальные фильтры.

Фильтрат вместе с соответствующей бактериальной культурой засевают в бульон и инкубируют при 37⁰С в течение 18-24 часов. Фаги размножаются, и после лизиса культуры оставшиеся бактериальные клетки удаляют центрифугированием или фильтрацией через бактериальный фильтр.

Титрование бактериофаговпроводят в жидкой (метод Аппельмана) или твердой (метод Грациа) питательной среде.

В пробирках с МПБ готовят десятикратные разведения бактериофага. В каждую пробирку вносят соответствующую бактериальную культуру по 0,1 мл. Через сутки инкубации в термостате при 37⁰С оценивают результаты. Наибольшее разведение фага, в котором отсутствует рост бактерий, принимаются за титр фага.

По методу Грациа на чашки с МПА наносят смесь фагов и бактерий. Для этого к расплавленному и остуженному до 45°С агару добавляют деситикратные разведения бактериофага и соответствующую тест культуру. Смесь быстро выливают на поверхность МПА. После застывания второго слоя агара чашки инкубируют при 37°С. Незараженные фагом бактерии, размножаясь, образуют сплошной газон роста на поверхности агара.

Каждая инфицированная фагом бактерия лизируется и освобождает потомство фага, состоящие из сотен новых фаговых частиц. Они внедряются в интактные клетки и весь цикл повторяется. В результате лизиса клеток фагом на сплошном бактериальном газоне появляются стерильные пятна. Число этих пятен соответствуют количеству фаговых частиц в засеянной смеси. Титр фага – максимальное разведение фага, при котором еще отмечаются стерильные пятна лизиса.

Практическое использование фагов.Применение фагов основано на строгой специфичности их действия. Фаги используют в диагностике инфекционных болезней: проводят идентификацию выделенных культур микроорганизмов – фаготипирование, т.е. устанавливают с помощью фага принадлежность неизвестной выделенной культуры бактерии к определенному виду или типу. Фаготипирование имеет большое эпидемиологическое значение, так как позволяет установить источник и пути распространения инфекций; с помощью тест-культуры можно определить неизвестный фаг в исследуемом материале, что указывает на присутствие в нем соответствующих возбудителей.

Фаги применяют для лечения и профилактики инфекционных болезней. Налажено производство брюшнотифозного, сальмонеллезного, дизентерийного, протейного, синегнойного, стафилококкового, стрептококкового, коли-фагов и комбинированных фагов. Фаги выпускают в жидком виде, в таблетках с кислотоустойчивым покрытием, в форме мазей, аэрозолей, свечей.

Бактериофаги используют для изучения структуры генома бактерий и в генной инженерии в качестве вектора – переносчика генов человека в бактерии. В настоящее время получены культуры бактерий, синтезирующие интерферон, интерлейкины, гормоны человека.

V. ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ