Раздел i. строение и свойства белков
ПО ТЕХНИКЕ БЕЗОПАСНОСТИ ДЛЯ СТУДЕНТОВ
ПРИ РАБОТЕ В ЛАБОРАТОРИЯХ
1. К работе в лабораториях допускаются студенты, прошедшие инструктаж по работе с реактивами и биопсийными материалами.
2. В лабораториях кафедры разрешается работать только в халате с длинными рукавами. Длинные волосы должны быть подобраны.
3. Все процедуры при выполнении работ по приготовлению препаратов, отмериванию реактивов (их переливание) должны проводиться только на своём рабочем месте на столе (или в вытяжном шкафу). Нагревание реактивов открытым огнём производится в специально оборудованном вытяжном шкафу. Запрещается проводить какие-либо манипуляции с реактивами над полом.
4. Необходимо соблюдать большую осторожность при работе с крепкими кислотами и щелочами (10% и выше). Особая аккуратность и осторожность необходимы при работе с концентрированными кислотами и щелочами, а также с другими агрессивными веществами (уксусный ангидрид, фенол, пергидроль и др.). Запрещается отмеривать такие реактивы путём подсасывания их ртом во избежание химического ожога полости рта. Отмеривание таких реактивов необходимо производить с помощью сифона или пипетки. Следует остерегаться попадания указанных реактивов на кожу (ожоги) и на одежду (разъедание тканей). Работу с этими веществами следует проводить в резиновых перчатках. При разбавлении крепких кислот для предупреждения разбрызгивания следует добавлять кислоту в воду, а не наоборот.
5. Пролитую щелочь надо засыпать песком или опилками. Затем песок или опилки убрать и это место залить сильно разбавленной кислотой (соляной, уксусной).
Пролитую кислоту следует засыпать песком (опилками нельзя), затем песок убрать лопатой и засыпать содой, потом удалить соду и промыть это место большим количеством воды (в резиновых перчатках).
6. При нагревании пробирок в пламени горелки возможно бурное вскипание и выброс содержимого на расстояние до 2-3 м, что особенно опасно в случае попадания кипящих брызг в лицо и глаза. Для предупреждения подобных случаев нагревание пробирок следует проводить у мениска жидкости, а не у дна, непрерывно вращая их и периодически вынимая из пламени. Надо следить, чтобы отверстие пробирки не было направлено на себя или на кого-нибудь из находящихся в лаборатории. Нельзя закрывать горячий раствор пробкой до полного остывания.
7. При сжигании (минерализации) органических веществ в колбах Къельдаля, при гидролизе белка, при анализе мочи, при работе с фенолом, уксусным ангидридом, хлористым бензолом, нитробензолом, анилином и другими подобными веществами в воздухе накапливаются раздражающие пары. Все указанные работы необходимо проводить в вытяжном шкафу.
9. Нельзя оставлять без присмотра горящие спиртовки. Запрещается держать вблизи открытого огня вату, марлю, спирт и другие легко воспламеняющиеся вещества.
10. При работе с центрифугой необходимо плотно закрывать крышку и запирать её на замок. Увеличивать скорость вращения можно лишь постепенно. Открывать крышку разрешается только после полной остановки ротора.
11. К работе на электромедицинской аппаратуре допускаются лица, изучившие инструкцию по безопасным приёмам работы, приложенную к аппарату.
Запрещается работать на аппаратуре, имеющей электрический пробой, нарушенную проводку, не имеющую заземления (кроме гальванической доски и низковольтной аппаратуры - 24-вольтовой сети).
При прекращении подачи электрического тока необходимо выключить все электроприборы.
12. Все вопросы по технике безопасности, возникающие в процессе работы, следует немедленно выяснить у преподавателя или лаборанта.
СОДЕРЖАНИЕ ЗАНЯТИЯ
I. Теоретическая часть.
I.1.Контроль исходного уровня знаний.
I.2.Обсуждение основных вопросов темы.
I.3.Тестовый контроль.
II. Практическая часть.
II.1.Выполнение лабораторных работ.
II.2.Самостоятельная работа с методическим
материалом.
II.3.Оформление результатов работы.
III. Заключительная часть.
III.1.Анализ полученных результатов.
III.2.Индивидуальный отчет по лабораторной работе.
III.3.Задание к следующему занятию.
III.4.Индивидуальная работа преподавателя со
студентами.
МАТЕРИАЛ ДЛЯ САМОПОДГОТОВКИ
I. ЛИТЕРАТУРА
а) обязательная
1. Т.Т.Березов, Б.Ф.Коровкин //Биологическая химия. М.: Медицина, 2002.
б) дополнительная
1. Т.Л.Алейникова, Г.В.Рубцова, Н.А.Павлова //Руковод-ство к практическим занятиям по биохимии.М.:Медицина, 2000.-126с.
2. Биохимия. //Под ред. Е.С.Северина. М.,Геотар-мед, 2003.-779с.
3. Горбунова В.Н., Баранов В.С. //Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. С.-Петербург:«Спец. лит-ра», 1997.-286с.
4. Климов А.Н., Никульчева Н.Г. //Обмен липидов и липопротеидов и его нарушения. С.-Петербург:«Питер», 1999.-505с.
5. Кольман Я., Рем К.-Г. //Наглядная биохимия. М.: Мир, 2000.-470с.
6. Крю Ж. // Биохимия. Медицинские и биохимические аспекты. М.: Медицина, 1979.
7. Ленинджер А. //Основы биохимии. М.: Мир, 1985.- т.I - III.
8. Марри Р. и др. //Биохимия человека. М.: Мир, 1993.-тт.I, II.
9. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. //Под ред.С.Херрингтона и Дж.Макги.М.: Мир, 1999.-560с.
10. Мецлер Д. //Биохимия. М.: Мир, 1980.- тт.I - III.
11. Николаев А.Я. //Биологическая химия. М.:Высшая школа, 1998.
12. Пустовалова Л.М.//Практикум по биохимии. Ростов на Дону: Изд-во Феникс, 1999.-544с.
13. Сборник тестов и задач по биохимии. //Под ред. акад. И.П.Ашмарина. М.: Изд-во МГУ, 1996.234с.
14. Страйер Л. //Биохимия. М.: Мир, 1984.-тт.I - III.
15. Строев Е.А. //Биологическая химия. М.: Высшая школа,1989.
16. Уайт А. и др. //Основы биохимии. М.: Мир, 1981.-тт.I - III.
17. Щербак И.Г. //Биологическая химия. С-Пб.: Изд-во СПбГМУ, 2005.-480с.
18. Элементы патологической физиологии и биохимии. //Под ред акад. И.П.Ашмарина. М.:Изд-во МГУ, 1997. – 237с.
19. Эллиот В., Эллиот Д. //Биохимия и молекулярная биология. М.:Изд-во НИИ Биомед.химии РАМН, 1999.-373с.
II. КОНСПЕКТЫ ЛЕКЦИЙ
III. МЕТОДИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ: тематические папки,
таблицы, плакаты и пр.
КРИТЕРИИ ОЦЕНКИ ЗНАНИЙ СТУДЕНТОВ
Студенту выставляется оценка:
ОТЛИЧНО - при глубоком знании программного материала, продемонстрированном: а) исчерпывающим ответом;
б) грамотным свободным владением теорией при решении логических задач и практических заданий; в) знакомством с дополнительной литературой.
ХОРОШО - при твердом знании и грамотном изложении программного материала, отсутствии существенных неточностей в ответе, правильном применении теоретических положений в решении практических вопросов и задач.
УДОВЛЕТВОРИТЕЛЬНО - при знании только основных положений программного материала и недостаточном усвоении его деталей, характеризующимся неточностями формулировок, недостаточно грамотным и последовательным ответом, затруднением в решении задач.
НЕУДОВЛЕТВОРИТЕЛЬНО - при отсутствии знаний по значительной части программного материала, при существенных ошибках в ответе, неумении использовать теоретический материал при решении логических задач.
Ч А С Т Ь П Е Р В А Я
ОБЩИЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ
ПРОЦЕССЫ В ЖИВЫХ ОРГАНИЗМАХ
Занятие № 1
ТЕМА.БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ И ФИЗИКО-ХИМИ-
ЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ
И ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ БЕЛКОВ
Цель занятия:
1.Повторить физико-химические и изучить биологические
свойства белков.
2.Ознакомиться с методикой выделения белков.
3.Усвоить принцип разделения белков на фракции методом
высаливания.
Исходный уровень знаний:
- кислоты и основания в органической химии;
- химические свойства карбоксильной группы;
- механизм нуклеофильного замещения у тригонального ато-ма углерода;
- химические свойства аминогруппы: основность и нуклео-
фильность;
- строение, амфотерность и растворимость аминокислот;
- коллоидные растворы и их свойства.
Содержание занятия.
I.2. Элементарный состав белков.
Классификация и номенклатура аминокислот, входящих в состав белков.
Функции белков.
Характерные физико-химические свойства белков.
Методы выделения и очистки белков.
II.1. Работа: ВЫСАЛИВАНИЕ БЕЛКОВ
Высаливание - это осаждение белков с помощью больших концентраций нейтральных солей: NaCl, (NH4)2 SO4 и др.
Принцип метода.
Реакция высаливания обусловлена дегидратацией макромолекул белка с одновременной нейтрализацией электрического заряда. Для высаливания различных белков требуется определенная концентрация одних и тех же солей. При высаливании белок обычно не теряет своих нативных свойств. Он может, например, вновь проявлять ферментативную активность. Метод высаливания позволяет получить белки в кристаллическом виде и разделить белковую смесь на фракции, а именно: белки сыворотки крови - на альбумины (А) и глобулины (Г). Глобулины, имеющие большую молекулярную массу, высаливаются в полунасыщенном (50%), а альбумины - в насыщенном (100%) растворе сернокислого аммония.
Хлористый натрий осаждает глобулины при полном насыщении (100%) раствора, а для осаждения альбуминов требуется еще и его подкисление.
Высаливание белков является обратимой реакцией, т.к. осадок белка опять может раствориться после уменьшения концентрации солей диализом или разведением водой.
Для определения белка в растворе используется универсальная биуретовая реакция.
Химизм биуретовой реакции. Биуретовая реакция выявляет в белке пептидную ( -CO-NH- ) связь. В щелочной среде раствор белка при взаимодействии с ионами меди приобретает сине-фиолетовый цвет, а продукты его неполного гидролиза (пептоны) - розовое окрашивание. Биуретовую реакцию способны давать вещества, которые содержат не менее двух пептидных связей. Биуретовая реакция обусловлена образованием биуретового комплекса в результате соединения меди с пептидной группировкой белка. В щелочной среде лактимные формы образуются из лактамных форм. Биуретовая реакция схематично протекает так:
H R2 O H R4 O
| | || | | || Cu(OH)2+2NaOH
H2N-CH-C-N-CH-C-N-CH-C-N-CH-C-N-CH- .....
| || | | || | |
R1 O H R3 O H R5
полипептид (лактамная форма)
R2 OH R4 OH
| | | |
H2N-CH-C=N-CH-C=N-CH-C=N-CH-C=N-CH- ....
| | | | |
R1 OH R3 OH R5
полипептид (лактимная форма)
| Положительную биуретовую реакцию отдельные аминокислоты не дают. Исключение: гистидин и аспарагин, с которыми биуретовая реакция происходит при условии их больших концентраций в растворе. |
R2
|
R1-HC-C=N-CH-C=N-CH-R3
| | | |
H2N O O C-ONa
||
Cu — ―N
↑ ¦
| R4-CH
| | СOONa COONa
| C -ОNа | |
| || CH-NH2 CH-NH2
└ ― ― ― — N | |
| CH2 CH2
CH-R5 | N N
N Cu N
биуретовый медный комплекс медный комплекс с гистидином
фиолетового цвета в случае биуретовой реакции
ПРИМЕЧАНИЕ: при постановке биуретовой реакции нельзя добавлять избыток сульфата меди, так как синий осадок гидрата окиси меди маскирует фиолетовое окрашивание биуретового комплекса белка.
Порядок выполнения работы.
| Реактивы | 1 пробирка | 2 пробирка |
| Раствор белка | 20 кап. | 20 кап. |
| Порошок NaCl | до полного насыщения | - |
| Насыщенный раствор (NH4)2SO4 | - | 20 кап. |
| ФИЛЬТРОВАНИЕ | ||
| Осадок | Глобулины | Глобулины |
| К фильтрату 1 добавить | ||
| 1% раствор CH3COOH | 10-20 кап. | - |
| Порошок (NH4)2SO4 | - | до полного насыщения |
| ФИЛЬТРОВАНИЕ | ||
| Осадок | Альбумины | Альбумины |
| КОНТРОЛЬ - БИУРЕТОВАЯ РЕАКЦИЯ | ||
| Фильтрат 2 | 5 кап. | 5 кап. |
| 10% NaOH | 5 кап. | 5 кап. |
| 1% CuSO4 | 1 кап. | 1 кап. |
| РЕЗУЛЬТАТЫ: |
ВЫВОД:
III.2.Контрольные вопросы.
Какие факторы удерживают белки в растворе?
Чем обусловлен коллоидный характер белковых растворов?
На чем основаны реакции осаждения белков?
Какие физико-химические свойства белков позволяют их
фракционировать?
Что такое высаливание?
С помощью какой реакции можно выявить белок
в растворе?
Какую окраску имеют белковые и безбелковые растворы
при проведении биуретовой реакции?
Какие отдельные аминокислоты могут дать
положительную биуретовую реакцию?
Чем отличаются альбумины и глобулины?
Материал для самоподготовки. I а)1. с.19-49, II, III.
Занятие № 2
ТЕМА. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БЕЛКОВЫХ
МОЛЕКУЛ. МЕТОДЫ ОЧИСТКИ БЕЛКОВ
Цель занятия: 1.Изучить структурную организацию белковой
молекулы как основу функционирования всех белков.
2.Ознакомиться с особенностями структуры фибриллярных
белков.
3.Освоить методы очистки белков от примесей на примере
диализа.
Исходный уровень знаний:
- аминокислоты: строение, классификация;
- ковалентные и нековалентные связи: характеристика, при-
меры;
- физико-химические свойства белков.
Содержание занятия.
I.2. Строение глобулярных белков (первичная, вторичная, третичная, четвертичная структуры).
Особенности строения молекулы фибриллярных белков.
Взаимосвязь структуры и функции белков.
Видовая специфичность первичной структуры и антигенные свойства белков.
Методы очистки белков (хроматография, электрофорез, диализ и др.).
Гидролиз белка (виды, условия, продукты полного и неполного гидролиза).
II.1. Работа: ДИАЛИЗ БЕЛКА
Принцип метода.
Диализ основан на способности полупроницаемых мембран пропускать сквозь поры низкомолекулярные вещества и задерживать высокомолекулярные коллоидные частицы. Ди-ализ является удобным методом очистки белков. При диализе коллоидный раствор помещают в коллодиевый или целлофановый мешочек и погружают в дистиллированную или водопроводную воду. Молекулы солей, сахаров и других низкомолекулярных веществ легко диффундируют через мембраны, а вещества коллоидной природы остаются в мешочке.
 |
Рис. 1. Варианты устройства системы для диализа белка. А) диализатор из стеклянного цилиндра с дном из полупроницаемой мембраны. Б) диализатор из коллодиевого мешочка. 1-держатель, 2-диализуемый раствор, 3-диализат.
Порядок выполнения работы.
В коллодиевый мешочек (диализатор) налить 5 мл солевого раствора белка. Погрузить в стакан с дистиллированной водой на 1 час. Через час с небольшими порциями диализата (наружная жидкость) проделать реакции на хлориды и белок и убедиться в том, что минеральные соли продиффундировали во внешний сосуд, а белок остался в содержимом мешочка.
Проба на белок (биуретовая реакция).
| Реактивы (кап.) | 1 пробирка (диализуемый раствор) | 2 пробирка (диализат) |
| Исследуемая жидкость | ||
| 10% раствор NaOH | ||
| 1% раствор CuSO4 | ||
| РЕЗУЛЬТАТЫ: | ||
| Проба на хлориды | ||
| Исследуемая жидкость | ||
| 10% раствор HNO3 | ||
| 1% раствор AgNO3 | ||
| РЕЗУЛЬТАТЫ: |
ВЫВОД:
III.2. Контрольные вопросы.
Что такое диализ?
Что такое диализат и диализуемая жидкость?
Какие реакции используются для контроля диализа?
Как используется диализ в медицине?
Материал для самоподготовки. I а)1. с.26-32, 49-71; II; III.
Занятие № 3
ТЕМА.КЛАССИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ. ХИМИЯ ПРОСТЫХ И
СЛОЖНЫХ БЕЛКОВ. МЕТОДЫ ОСАЖДЕНИЯ БЕЛКОВ
Цель занятия: 1.Ознакомиться с классификацией белков, харак-
теристиками отдельных групп белков и пептидов.
2.Освоить методы осаждения белков.
Исходный уровень знаний:
- строение и свойства белков;
- биологическая роль белков.
Содержание занятия.
I.2. Характеристика основных групп простых белков.
Принцип классификации сложных белков.
Характеристика природных пептидов.
Содержание белков и аминокислот в крови в норме и при патологии.
I.3. Контрольная работа.
СВОДНЫЕ ВОПРОСЫ К КОНТРОЛЬНОЙ РАБОТЕ
ПО РАЗДЕЛУ "СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА БЕЛКОВ"
1. Определение класса белков. Элементарный состав, наименьшая структурная единица, молекулярная масса белков.
2. Классификация аминокислот, входящих в состав белков, основанная на полярности радикалов; примеры неполярных, полярных, положительно- и отрицательно заряженных аминокислот.
3. Амфотерность и растворимость аминокислот. Функциональные группы аминокислот, участвующие в образовании ковалентных, ионных, электростатических и гидрофобных (Ван-дер-Ваальса) связей белковой молекулы.
4. Структура и название аминокислот, производных пропионовой, масляной, валериановой, капроновой, янтарной и глутаровой кислот.
5. Структура и название окси- и серусодержащих, гомо- и гетероциклических аминокислот.
6. Факторы, удерживающие белок в растворе. Изоэлектрическая точка белков. Методы осаждения белков, значение для медицины. Обратимое и необратимое осаждение. Примеры.
7. Основные физико-химические свойства белков. Свойства коллоидных растворов, отличительные от свойств истинных растворов. Методы выделения и очистки белков. Диализ, значение для медицины.
8. Методы обнаружения белков в растворе и изучения качественного состава белка. Гидролиз белка, виды гидролиза, промежуточные и конечные продукты. Применение белковых гидролизатов в лечебной практике.
9. Назовите трипептид, например:
H3C-CH-CH2-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-COOH
| | | |
CH3 NH2 CH3 CH2
|
CH2-S-CH3
 |  | ||
-CH2-CH-CO-NH-CH-CO-N
| | |
NH2 (CH2)3 COOH
|
CH2NH2
10. Напишите трипептид: а) глицил-валил-изолейцин;
б) лейцил-тирозил-гистидин; в) аланил-метионил-триптофан и т.п.
11. Белки - основа жизненных процессов. Значение работ А.Я.Данилевского, Э.Фишера, Л.Полинга в формировании представлений о строении белков. Уровни структурной организации белковой молекулы.
12. Первичная структура, формирующие её связи. Зависимость биологических свойств белков от характера аминокислотной последовательности в полипептидной цепи ( HbA, HbS ).
13. Конформация пептидных цепей в белках: вторичная и третичная структуры, связи, определяющие эти структуры. Об-ратимая и необратимая денатурация белков; причины, значение.
14. Высшая форма организации белковой молекулы - четвертичная структура. Кооперативные изменения конформации протомеров (на примере гемоглобина и миоглобина).
15. Зависимость функциональных свойств белков от их конформации. Способность к специфическим взаимодействиям ("узнавание") как основа функционирования всех белков. Антигенные свойства белков.
16. Биологические функции белков. Различия белкового состава органов. Изменение белкового состава при онтогенезе и болезнях.
17. Классификация белков. Химия сложных белков. Важ-нейшие представители простых и сложных белков в организме человека.
18. Структурные белки. Классификация, особенности строения, распределение в тканях. Самосборка многомолекулярных белковых структур на примере коллагеновых волокон.
II.1. Работа № 1. ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ ПРИ КИПЯЧЕНИИ
Принцип метода основан на денатурации большинства белков при нагревании их растворов при температуре свыше 5О-6О0С, что приводит к потере растворимости, особенно в изоэлектрической точке.
Почти все белки свертываются и осаждаются при нагревании в нейтральной и слабокислой среде. В сильнокислых и щелочных средах растворы белков при кипячении денатурируют, но не коагулируют и могут дать осадок лишь при добавлении достаточного количества какой-либо нейтральной соли (NaCl, сернокислый аммоний и др.). Устойчивость белка в растворе зависит от приобретения (+) заряда в случае сильнокислой среды и усиления (-) заряда в щелочной среде.
+H+ -H+
H3N+-CH-COOH H3N+-CH-COO- H2N-CH-COO-
| | |
R R R
молекула заряжена цвиттерионная молекула заряжена
"+" форма аминокислоты "-"
рН = 2-3 рН = 4-9 рН = 9-10
(биполярная форма)
При понижении рН диссоциация карбоксильной группы подавляется и молекула становится положительно заряженной. При повышении pH происходит отрыв связанного протона аминокислоты и молекула приобретает отрицательный заряд. Более полное и быстрое осаждение происходит при достижении изоэлектрической точки. Изоэлектрической точкой называют такое значение рН, при котором суммарный электрический заряд белка равен нулю и, следовательно, белок при этом в электрическом поле теряет подвижность, т.е. остается на старте. Для большинства белков изоэлектрическая точка соответствует слабокислой среде (в пределах от 5,5 до 6,9).
Итак, важную роль в денатурации белков при нагревании играет концентрация водородных ионов, т.е. определенная реакция среды, и присутствие солей.
Порядок выполнения работы:
| Реактивы (кап.) | Пробирки | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| 1% раствор яичного белка | |||||
| 1% раствор CH3COOH | - | - | |||
| насыщенный раст-вор NaCl | - | - | - | - | |
| 10% раствор NaOH | - | - | - | - | |
| КИПЯЧЕНИЕ | |||||
| Реакция среды | Нейт-ральная | слабо-кислая | сильнокислая | сильнокислая, + электролит | щело-чная |
| РЕЗУЛЬТАТЫ: |
ВЫВОД:
Работа № 2a. ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ СОЛЯМИ
ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ
Принцип метода.
Осаждение белков солями тяжелых металлов в отличие от высаливания происходит при небольших концентрациях солей. Белки при взаимодействии с солями тяжелых металлов (свинца, меди, серебра, ртути и др.) адсорбируют их, образуя солеобразные и комплексные соединения, растворимые в избытке этих солей (за исключением солей AgNO3, HgCl2), но нерастворимые в воде.
Растворение осадка в избытке солей называется адсорбционной пептизацией. Данное явление происходит вследствие возникновения одноименного (+) заряда на частицах белка. Способность белка прочно связывать ионы тяжелых металлов в виде нерастворимых осадков в воде используется как противоядие при отравлении солями ртути, меди, свинца и др. Обычно применяют белки молока и яиц сразу после отравления, пока эти соли еще находятся в желудке и не успели всосаться. Вслед за введением белка у больного вызывают рвоту, чтобы удалить остатки яда из организма.
Порядок выполнения работы.
| Реактивы (кап.) | Пробирки | ||
| 1 | 2 | 3 | |
| а) Раствор яичного белка | |||
| 1% раствор CuSO4 | - | - | |
| 5% раствор Pb(CH3COO)2 | - | - | |
| 5% pаствор AgNO3 | - | - | |
| РЕЗУЛЬТАТЫ: | |||
| б) продолжение опыта в тех же пробирках (добавить) | |||
| 1% раствор CuSO4 | 5-10 | - | - |
| 5% pаствоp Pb(CH3COO)2 | - | 5-10 | - |
| 5% pаствоp AgNO3 | - | - | 5-10 |
| РЕЗУЛЬТАТЫ: |
ВЫВОД:
Работа № 2б. ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ КОНЦЕНТРИРОВАН-
НЫМИ МИНЕРАЛЬНЫМИ КИСЛОТАМИ
Принцип метода.
Концентрированные минеральные кислоты вызывают денатурацию белка и образуют комплексные соли белка с кислотами. В избытке всех минеральных кислот, за исключением азотной, выпавший осадок белка растворяется. Качественная реакция с концентрированной HNО3 лежит в основе количественного определения белка в моче по методу Робертса-Столь-никова-Брендберга.
Порядок выполнения работы:
| Реактивы (кап.) | I этап | II этап | ||
| Пробирки | ||||
| Концентрированная HNO3 | - | - | ||
| Концентрированная H2SO4 | - | - | ||
| Раствор белка | - | - | ||
| Примечание: Раствор белка осторожно наслоить на кислоту по стенке пробирки, наклоненной под углом 450. | ||||
| РЕЗУЛЬТАТЫ: |
ВЫВОД:
 |
Рис. 2. Наслаивание пробы на концентрированную кислоту:
1 -раствор белка; 2-кислота.
III.2. Контрольные вопросы.
Какие факторы удерживают белки в растворе?
Чем обусловлена реакция осаждения белков?
Что такое коагуляция белков? Виды коагуляции.
Что такое денатурация белка? Виды денатурации.
При каких условиях происходит: коагуляция
с денатурацией; коагуляция без денатурации;
денатурация без коагуляции?
Что такое адсорбционная пептизация?
Как используется в медицине реакция адсорбционной
пептизации?
Материал для самоподготовки: I а)1. с.19-74, 662-565. II, III.
РАЗДЕЛ II. ФЕРМЕНТЫ
Занятие № 4
ТЕМА. СТРОЕНИЕ И ОСНОВНЫЕ
СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ
Цель занятия: 1.Повторить материал по физико-химическим
свойствам белков.
2.Ознакомиться с современными представлениями о структу-
ре ферментов, изучить их характерные свойства.
Исходный уровень знаний:
- строение и физико-химические свойства белков;
- понятие о катализаторах.
Содержание занятия.
I.2. Понятие о катализе.
Химическая природа ферментов.
Свойства ферментов.
Строение ферментов (функциональные центры, их строение).
Факторы, определяющие активность ферментов.
Витамины как коферменты.
Понятие об изоферментах.
Мультимолекулярные ферментные системы.
II.1.Работа № 1.ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА
АКТИВНОСТЬ АМИЛАЗЫ СЛЮНЫ
Принцип метода и химизм.
Амилаза слюны (a-1,4-гликозидаза) катализирует гидролиз a-1,4-гликозидной связи крахмала и гликогена до дисахарида мальтозы с промежуточным образованием декстринов различного размера. Нерасщепленный крахмал с йодом дает синее окрашивание, амилодекстрины - фиолетовое, эритродекстрины - красно-бурое, ахродекстрины и мальтоза - желтое (цвет водного раствора йода, т.е. окрашивания с йодом не дают). Конечные продукты гидролиза крахмала - мальтоза и глюкоза - имеют свободную альдегидную группу и могут быть обнаружены реакцией Троммера, в основе которой лежит окислительно-восстановительная реакция. При нагревании альдегидная группа окисляется до глюконовой кислоты, а медь гидрата окиси меди (голубого цвета) - восстанавливается в гидрат закиси меди (желтого цвета). При дальнейшем нагревании образуется красная закись меди:
H O
C=O + 2CuSO4 + 5NaOН ® C–O–Na + 2CuOH + 2Na2SO4 + 2H2O
R R
Одним из характерных свойств ферментов является термолабильность, т.е. чувствительность фермента к температуре. Для многих ферментов максимальная ферментативная скорость наблюдается при 38-400C. Эта температура называется температурным оптимумом. При нагревании свыше 700С они утрачивают свои свойства биологических катализаторов. Степень инактивирования зависит от длительности теплового воздействия. Замедление и прекращение ферментативной реакции происходит вследствие тепловой денатурации белковой молекулы фермента. При низких температурах ферменты не денатурируются, но скорость реакции резко снижается за счет снижения кинетической энергии молекул. О действии фермента судят по исчезновению субстрата или появлению продуктов реакции.
Порядок выполнения работы:
В чистую пробирку собрать примерно 2 мл нативной (неразведенной) слюны и кипятить в течение 5 минут, охладить.
| Реагенты (кап.) | Пробирки | ||
| 1-я | 2-я | 3-я | |
| 1% раствор крахмала | |||
| Нативная слюна, разведенная в 10 раз | - | - | |
| Прокипяченная неразведенная слюна | - | - | |
| Дистиллированная вода | - | - | |
| Поместить в термостат при 380С на 10 мин. Из содержимого каждой пробирки отлить по 5 капель в дополнительные пробирки. а) йодная проба (на крахмал) | |||
| Реагенты (кап.) | Пробирки | ||
| 1-а | 2-а | 3-а | |
| Исследуемый раствор | |||
| Раствор йода в йодистом калии | |||
| РЕЗУЛЬТАТЫ: | |||
| б) реакция Троммера (на глюкозу и мальтозу) | |||
| Реагенты (кап.) | 1-б | 2-б | 3-б |
| Исследуемый раствор | |||
| 10% раствор NаОН | |||
| 1% раствор CuSO4 | |||
| РЕЗУЛЬТАТЫ: |
ВЫВОД:
Работа № 2. ВЛИЯНИЕ РЕАКЦИИ СРЕДЫ НА АКТИВ-
НОСТЬ ФЕРМЕНТОВ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ
ОПТИМУМА рН
Принцип метода и химизм.
Для разных ферментов существует свой оптимум рН среды, когда фермент наиболее активен. Например, оптимум рН пепсина (фермент желудочного сока) - 1,5-2,0; аргиназы (фермент печени) - 9,5. Для амилазы слюны оптимум рН - 6,8-7.2; в кислой и щелочной среде активность ее снижается за счет взаимодействия белковой молекулы с ионами раствора.
Химизм реакции см. выше (раб. N1).
Порядок выполнения работы:
Слюну развести в 10 раз. Взять 5 пробирок и приготовить смеси в соответствии с таблицей (все растворы берутся в каплях).
| Реактивы | Пробирки | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| раствор 1 | |||||
| раствор 2 | |||||
| 1% раствор NaCl | |||||
| рН | 5,8 | 6,9 | 7,4 | 7,9 | 8,5 |
| 0,5% раствор крахмала | |||||
| Слюна разведенная | |||||
| Перемешать, поместить в термостат при температуре 380С на 10 минут | |||||
| раствор йода | |||||
| Окраска | |||||
| Продукты гидролиза крахмала |
ВЫВОД:
Работа № 3. СПЕЦИФИЧНОСТЬ ДЕЙСТВИЯ
АМИЛАЗЫ СЛЮНЫ
Принцип метода.
Ферменты обладают специфичностью, т.к. способны катализировать только определённые химические реакции. Специфичность действия ферментов бывает абсолютная, относительная и стереохимическая. Она определяется тем, что только некоторые строго определённые функциональные группы, входящие в состав ферментов, могут участвовать в образовании фермент-субстратных комплексов.
Амилаза слюны ускоряет гидролиз только полисахаридов, не оказывая действия на дисахариды. Мальтаза слюны ускоряет гидролиз образующегося дисахарида мальтозы и не оказывает действия на сахарозу.
Химизм реакции см. в работе N 1.
Порядок выполнения работы:
| Реактивы (кап.) | 1-я пробирка | 2-я пробирка |
| Слюна, разведенная 1:5 | ||
| 1% раствор крахмала | - | |
| 1% раствор сахарозы | - | |
| Поместить в термостат при температуре 380С на 10 минут | ||
| Реактив Фелинга | ||
| Нагреть до кипения и кипятить 1 мин | ||
| РЕЗУЛЬТАТЫ: |
ВЫВОД:
III.2. Контрольные вопросы.
Как и почему активность ферментов зависит от температуры?
Что такое температурный оптимум ферментов?
Как и почему активность ферментов зависит от рН среды
(график)?
Какие ферменты активны в кислой; нейтральной;
щелочной среде?
Что такое специфичность ферментов?
Какие виды специфичности ферментов Вы знаете?
Примеры.
Укажите качественную реакцию на крахмал.
Материал для самоподготовки: I а) 1. с.44-49, 114-129,
139-143; II; III.
Занятие № 5
ТЕМА. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ,
КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ
Цель занятия: Ознакомиться с современными представлениями о механизме действия ферментов и кинетике ферментативных реакций.
Исходный уровень знаний:
- белковая природа ферментов;
- структура сложных ферментов;
- строение молекулы фермента;
- кинетика химических реакций.
Содержание занятия.
I.2. Современные представления о механизме действия ферментов (гипотеза Фишера, Кошланда).
Полифункциональный катализ.
Кинетика ферментативных реакций. Константа Михаэлиса.
Зависимость активности ферментов от различных факторов.
Определение активности ферментов: принцип, значение в меди<