Реакция связывания комплемента, методы постановки, механизм и использование ее в бактериологии
Реакция связывания комплемента основана на способности комплемента полностью или частично адсорбироваться на комплексе антиген+антитело. Адсорбция комплемента на комплексе антиген+антитело визуально не проявляется, т.е. видимого комплекса не образует. Для того, чтобы установить произошла адсорбция комплемента или он остался свободным, в реакцию вводится вторая система – индикаторная, гемолитическая. Она состоит из антигена (эритроцитов барана) и антител (гемолитическая сыворотка). Если комплемента в растворе нет, так как он адсорбировался на комплексе антиген+антитело в первой части реакции, гемолиза во второй части реакции не будет, эритроциты осядут на дно пробирки, реакция положительная. Если же комплемент остался в растворе, так как нет взаимодействия между антигеном и антителами в первой части реакции, то наступает гемолиз эритроцитов, образуется «лаковая кровь», реакция отрицательная.
РСК характеризуется высокой специфичностью и чувствительностью. Она может быть применена для диагностики почти всех инфекционных заболеваний, как для обнаружения антигена, так и для определения антител. Сложность постановки реакции обусловлена количеством вводимых компонентов, необходимостью определять точные количественные соотношения.
1. Исследуемая или свежее взятая иммунная сыворотка перед опытом подвергается прогреванию при 56°С в течение 30 мин для инактивации, т.е. разрушения собственного комплемента. После инактивации сыворотку разводят 1:5.
2. Антиген готовят или из культур микробов или органов инфицированного или здорового животного. Антиген титруют и определяют то его количество, при котором отсутствует тормозящее на комплемент действие.
3. Комплемент титруют и определяют его рабочую дозу. Рабочая доза комплемента – это количество комплемента, увеличенное против титра на 25-30%. Это необходимо потому, что активность комплемента может быть несколько подавлена другими ингредиентами.
4. Гемолитическая сыворотка титруется, для постановки реакции используют сыворотку, усиленную против титра в 3-4 раза. Например, если титр сыворотки 1:1800, то в реакции применяют разведение 1:600.
5. Эритроциты барана получают из стерильно взятой дефибринированой крови, их отмывают, центрифугируя трижды с новыми порциями физиологического раствора, а потом готовят 3% взвесь.
Из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки готовят гемолитическую систему, смешивая равные объемы сыворотки и эритроцитов.
Только после подготовки всех компонентов ставят основной опят РСК.
127. Реакция связывания комплемента, методы постановки, механизм и использование ее в вирусологии.
В вирусологии с помощью РСК выявляют антигены вирусов и антитела у больных в целях ранней и ретроспективной (после заболевания) диагностики вирусных инфекций.
При постановке реакции в качестве антигена используют вируссодержащий материал: жидкости эмбриона, зараженного вирусом, взвеси инфицированных тканей животного, зараженного вирусом, экстракты клеток культур ткани вместе с культуральной жидкостью, кровь, спинномозговую жидкость, мочу, испражнения больного человека.
Особенностью постановки РСК является постановка реакции на холоду, когда пробирки с основной реакцией, содержащие сыворотку, антиген и комплемент для взаимодействия выдерживают 18-20 часов при 4°С в холодильнике, после чего добавляют гемолитическую систему и через 45 мин учитывают результат. При постановке РСК для обнаружения прироста антител, также как и при постановке других серологических реакций, используют парные сыворотки.
128. Опсоно-фагоцитарная реакция. Фагоцитарная активность и интенсивность. Практическое применение.
Применяется для олределения опсонинов — антител, стимулирующих фагоцитарную активность лейкоцитов, т.е. серодиагностики инфекций, например, бруцеллёза.
Усиление фагоцитоза происходит за счёт присоединения опсонинов с активными центрами (Рав-фрагмент) к детерминантам бактерий, а затем с помощью Рс-фрагментов к Рс-рецепторам фагоцитов. В нормальной сыворотке содержится небольшое количество опсонинов, которые проявляют свое действие в присутствии комплемента. В иммунной сыворотке опсонинов больше, и их активность в меньшей степени зависит от комплемента.
Компоненты:Исследуемая сыворотка, Нормальная сыворотка, Суточная микробная культура (напр., стафилококковая) Фагоциты — взвесь нейтрофилов
Инкубация при 37 °С в течение 30 минут. Из каждой пробирки готовят мазки, окрашивают по Романовскому-Гимзе и считают под микроскопом количество микробов, в 100 и более нейгрофилах, т.е. определяют фагоцитарный показатель.
Фагоцитарный показатель — количество микробов, поглощенных одним нейтрофилом.
Опсонический индекс фагоцитарный показатель иммунной (исследуемой) сыворотки / фагоцитарный показатель нормальной сыворотки.
Чем выше опсонический индекс (должен быть > 1), тем выше иммунитет.
Опсоно-фагоцитарный индекс — это цифровой показатель = количество фагоцитов х оценка фагоцитоза (в зависимости от количества поглощенных микробов). Максимальный показатель -75.
129. Реакции иммунитета с участием комплемента, методы их постановки и практическое применение.
Реакции с участием комплемента основаны на активации комплемента в результате присоединения его к антителам, находящимся в комплексе с антигеном (реакции связывания комплемента, радиального гемолиза и др. ). Реакция связывания комплемента двухфазная; первая фаза - инкубация смеси искомого антигена (или антитела) с диагностической сывороткой (или антигеном-диагностикумом) и комплементом; вторая фаза - индикаторная - определение наличия в смеси свободного комплемента путем добавления гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, содержащей антитела против эритроцитов барана. В первой фазе реакции при образовании комплекса антиген-антитело происходит связывание им комплемента, во второй фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов отсутствует (реакция положительная). При отрицательной реакции, если антиген и антитело не соответствуют друг другу, комплемент остается свободным и во второй фазе реакции присоединяется к комплексу эритроцит-антиэритроцитарное антитело гемолитической сыворотки, вызывая гемолиз. Реакция связывания комплемента применяется для диагностики инф. болезней, в частности сифилиса
130. Реакции иммунитета с мечеными антигенами или антителами (иммунофлюоресценции, радиоиммунный, иммуноферментный). Практическое применение.
Серологические реакции, в которых используются меченые антигены или антитела, отличаются высокой чувствительностью и находят все более широкое применение в диагностике инфекционных заболеваний как для обнаружения и идентификации антигена в исследуемом материале, так и для обнаружения антител в сыворотке крови больных. Метят антигены или антитела флюорохромами, ферментами или радиоактивными изотопами. При этом антигены и антитела, образовывая комплексы с метками, не утрачивают способности к иммунному реагированию.
Реакция иммунофлюоресценции используется для выявления микробных или вирусных антигенов, локализованных в пораженных тканях или патологическом материале. Меченые антитела получают путем обработки иммунной сыворотки флюорохромами.
Различают два варианта постановки реакции иммунофлюоресценции:
а) Прямой метод Кунса.Метод заключается в обработке среза ткани или мазка из патологического материала сывороткой, содержащей антитела к предполагаемому антигену, меченые флюорохромом. После промывания препарата, при котором удаляются свободные антитела, его просматривают в люминесцентном микроскопе. Если в препарате присутствует антиген, он свяжется с мечеными антителами, образуется комплекс, который будет давать свечение в ультрафиолетовом свете.
б) Непрямой метод Веллера и Кунса ставится в два этапа. На первом этапе препарат обрабатывают диагностической иммунной сывороткой. На втором этапе -
люминесцирующей антисывороткой. При положительном результате
образуется иммунный комплекс, состоящий из антигена, антител к нему
и меченых антиглобулинов, этот комплекс будет светиться в ультрафиолетовых лучах.
Метод иммунофлюоресценции применяют для: 1) индикации и идентификации гетеро- и аутоантигенов (бактерий, вирусов, грибов); 2) доказательства выработки антител определенной специфичности (выявление антител к ДНК, тканевому антигену щитовидной железы); 3) доказательства реакции антиген+антитело в тканях (при сывоточной болезни, гломерулонефрите и т.п.); 4) выявления антител в сыворотке крови.
Радиоиммунный метод
Для метки антигена или антитела используют радиоактивные изотопы Применение радиоактивной метки возможно, если меченные антигены и антитела сохраняют способность взаимодействовать друг с другом. Метод более чувствителен, чем предыдущий, точен при количественной оценке антигена или антитела.
Реакцию учитывают путем измерения радиоактивности в образовавшемся комплексе антиген+антитело. При постановке реакции используют модификации:
А) Классический радиоиммунный метод. Метод основан на конкуренции за антитело между меченным стандартным антигеном и немеченым антигеном, содержащимся в исследуемом материале.
Эта модификация нашла широкое применение не только при решении иммунологических проблем, с ее помощью можно обнаружить минимальные количества некоторых веществ в биологических жидкостях, например, инсулина.
Б) Техника «твердая фаза». В данной модификации антиген или антитело адсорбируют на поверхности полимеров: полистирола, полиэтилена, сефадекса и др. В зависимости от характера реакции различают следующие методы:
1) методы, основанные на конкуренции антигенов. Принцип метода заключается в том, что определяемый и меченный антигены конкурируют за антитела известной концентрации, осажденные на сорбенте. Чем больше антигена содержится в исследуемом материал, тем больше антител с ним свяжется, тем меньше меченого антитела будет на субстрате. На этом принципе основано определение IgЕ, ряда гормонов, лекарственных веществ.
2) неконкурентные методы. Принцип заключается во взаимодействии антигена (или антитела) и антителами (или антигенами) известной специфичности, адсорбированными на сорбенте, после чего к ним добавляют меченые антиглобулины и после инкубации определяют содержание радиоактивных реагентов. Данный тест в практике используется для определения HBs-антигена.
3) «Сандвич-метод» представляет собой модификацию «неконкурентных» методов. Принцип заключается в инкубации определенного антигена с антителами к нему, после отмывания не связавшихся антител, смесь обрабатывают соответствующей меченой антисывороткой, после чего оценивают количество антигена с помощью счетчика. Этим методом можно обнаружить содержание IgЕ, антигена гепатита В, антигенов гистосовместимости, антител к ДНК.
Особой формой метода является авторадиография, заключающаяся в обработке срезов тканей мечеными антителами известной специфичности. Метод позволяет определить локализацию антигена, например, мембранных рецепторов лимфоцитов.
Иммуноферментный метод
Разработаны различные варианты метода в зависимости от вида фермента и системы антиген – антитело. В качестве ферментных меток применяют щелочную фосфатазу, пероксидазу из хрена, β-галактозидазу.
Для количественного анализа применяют две модификации ИФА.
В первой модификации антиген, меченный ферментами, конкурирует с немеченым исследуемым антигеном за связывание с антителами и ферментная активность обратно пропорциональна количеству антигена в исследуемом материале. Во второй модификации конкурентные отношения отсутствуют.
Преимуществом метода является отсутствие контакта с радиоактивными веществами.
В настоящее время метод ИФА очень широко применяется в различных отраслях медицины. Широко им пользуются в вирусологии для выявления вирусных антигенов или антител к вирусам. Разработаны тест-системы ИФА для выявления стафилококковых энтеротоксинов, дифтерийного токсина, антител к пневмококку и т.д.