Методы молекулярной генетики

Все шире применяется чувствительный метод молекулярного количественного анализа вирусных ДНК и РНК, позволяющий диагностировать новую или реактивацию хронической инфекции (ЦМВ, вирус Эпштейн-Барр, вирус простого герпеса, полиома вирус (BK) и т.д.) за недели до иммунологического ответа. При этом воспроизводимость, чувствительность и сопоставимость методов, обусловленные мутацией изменения и интерпретация динамики титров на фоне лечения – предметы постоянных дискуссий. Анализы экспрессии генов показывают различия в зависимости от исследуемого материала (кровь, биопсии), времени и воздействия внешних факторов. В настоящее время (с 2007г.) имеется возможность бесплатного исследования изолированной ДНК (предпочтительнее, чем цельная кровь) на мутации генов некоторых заболеваний почек в Университете Мичигана, США (www.renalgenes.org). Методы генной активации с количественным определением РНК дают информацию об иммуно-воспалительных процессах в почках (моча, биопсия) и в организме в целом (кровь), позволяют выявить индикаторы обострения заболевания (отторжение трансплантата, СКВ, ФСГС и т.д.) Возможно получение информации о наличии так называемых суррогатных маркеров еще до наступления морфологических проявлений заболевания, при неэффективности терапии. Исследование активации отдельных генов, которые находятся в фазе изучения, должно обсуждаться только с опытным детским нефрологом. В приложении 5 представлены возможности молекулярной генетики в диагностике различных наследственных заболеваний почек.

Тем не менее, молекулярная диагностика не освобождает нас от выяснения точной клинической и гистопатологической картины болезни. Прогноз болезни на основании генетических исследований во время беременности требует критического подхода, основанного на законах генетики человека. В связи с дороговизной метода, важна скоординированность педиатров с детскими нефрологами и генетиками для максимально целенаправленного применения молекулярной диагностики.

Таким образом, в течение последних 20 лет произошел значительный прогресс в диагностических подходах в нефрологии. При скрининговом исследовании мочи информативность показали тест-полоски. Были упрощены и стандартизированы методы для диагностики гематурии и протеинурии, определения электролитов в сыворотке крови и моче. Методы определения сывороточных креатинина и мочевины были дополнены определением цистатина С. Разработанные формулы и диаграммы параметров сыворотки крови и мочи позволили получить представление о патофизиологических процессах, лежащих в основе болезней почек. Тем не менее, оценка скорости клубочковой фильтрации с помощью формул, по-прежнему представляет собой слабое звено в диагностике, тогда как более точные методы оценки клиренса инвазивны, требуют затраты времени и средств, либо сопряжены с радиационной нагрузкой. В будущем могут быть сужены показания к биопсии почки в связи с более широким применением информативных неинвазивных, но очень дорогостоящих (протеомика) методов диагностики, используемых в развитых странах. Терапевтический лекарственный мониторинг защищает пациентов от недостаточной или избыточной дозировки медикаментов при иммуносупрессивной терапии или при почечной недостаточности. Молекулярно-биологические исследования, в частности, определение цитокинов, пока остаются на стадии разработки, в связи с чем недоступны для широкого применения. Молекулярно-генетические исследования позволяют диагностировать редкие наследственные заболевания, но не способны заменить тщательного клинического и патофизиологического обследования. Поэтапная диагностика и алгоритмы облегчают постановку диагноза при тяжелых состояниях в нефрологии (см. приложения).

ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение 1.Суточный мониторинг артериального давления у детей.

Мальчики

Рост см	24-часовое	Дневное (08:00 – 20:00)	Ночное (08:00 – 20:00)
50-й перцен	95-й перцен	50-й перцен	95-й перцен	50-й перцен	95-й перцен
	105/65	113/72	112/73	123/85	95/55	104/63
	105/65	117/75	113/73	125/85	96/55	107/65
	107/65	121/77	114/73	127/85	97/55	110/67
	109/66	124/78	115/73	129/85	99/56	113/67
	112/66	126/78	118/73	132/85	102/56	116/67
	115/67	128/77	121/73	135/85	104/56	119/67
	120/67	130/77	124/73	137/85	107/56	122/67

Девочки

Рост см	24-часовое	Дневное (08:00 – 20:00)	Ночное (08:00 – 20:00)
50-й перцен	95-й перцен	50-й перцен	95-й перцен	50-й перцен	95-й перцен
	102/65	113/73	111/72	120/84	96/55	107/66
	105/66	117/75	112/72	124/84	97/55	109/66
	108/66	120/76	114/72	127/84	98/55	111/66
	110/66	122/76	115/73	129/84	99/55	112/66
	111/66	124/76	116/73	131/84	100/55	113/66
	112/66	124/76	118/74	131/84	101/55	113/66
	113/66	124/76	120/74	131/84	103/55	114/66

Приложение 2.Основные биохимические показатели сыворотки крови, в норме

Общий белок	62 – 80 г/л
Альбумины	35 – 52 г/л (56,5-66,5%)
Глобулины	18 – 34 г/л (33,5-43,5%)
Альфа1	(2,5-5%)
Альфа2	(5,1-9,2%)
Бета	(8,1-12,2%)
Гамма	(12,8-19,0%)
Креатинин	50-115 мкмоль/л
Мочевина	4,20-8,3 ммоль/л
Клубочковая фильтрация	80-120 мл/мин
Канальцевая реабсорбция	97-99 %
Мочевая кислота	149-404 мкмоль/л (жен) 214-458 мкмоль/л (муж)
Кальций общий	2,2-2,75 ммоль/л
Кальций ионизированный	1,0-1,15 ммоль/л
Хлориды	95-110 ммоль/л
Неорганический фосфор	0,81-1,55 ммоль/л
Щелочная фосфатаза	31 – 108 ед.
Железо	7,16-26,85 мкмоль/л (жен) 8,95-28,65 мкмоль/л (муж)
Общая железосвязывающая способность сыворотки крови	50-84 мкмоль/л
Ферритин	12-150 мкг/л (жен) 15-200 мкг/л (муж)
Процент насыщения трансферрина железом	16-50 %

Приложение 3. Показатели кислотно-основного состояния крови

РН	Капилл, кровь
	венозная кровь	7,32-7,42
Напряжение углекислого газа в крови (рСО2)
Капилл кровь	муж.	32-45 мм. рт. ст.
	жен.	35-48 мм. рт. ст.
Венозная кровь		42-55 мм. рт. ст.
Напряжение кислорода в крови (рО2)
Капилл кровь		83-108 мм. рт. ст.
Венозная кровь		37-42 мм. рт. ст.
Кислород, % насыщения		95-98 %
Бикарбонат плазмы крови стандартный (АВ, ВS)
Капилл кровь		18-23 ммоль/л
Венозная кровь		22-29 ммоль/л
Буферные основания (В. В.)		43,7-53,6 ммоль/л
Избыток оснований (В. Е.)		0±2,3 ммоль/л
Общая углекислота (Н2СО3)		22,2-27,9 ммоль/л

Приложение 4. Протокол биопсии почки. (Медицинский Университет Ганновера, Детская Клиника).

В день поступления:

- Постановка периферического катетера и забор крови:тромбопластиновое время, ЧТВ, развернутая гемограмма, КЩС, креатинин, мочевина, Ca, P, общий белок, «С» реактивный белок, группа крови (при Вх нативной почки).

- Подписанное родителями ребенка согласие на проведение Вх

В день биопсии:

- Пациента не кормить за 6 часов до Вх (с 2:00 ночи)

- Премедикация: Мидазолам (Дормикум) 0,1 мг перорально

- Для Вх: Кетанест и Мидазолам в/в, контрольный лист препаратов крайней необходимости, дыхательный мешок и оксигенатор, мешок с песком (около 0.5-1.0 кг)

Биопсия:

- Проводится в отделении или палате интенсивной терапии

- Ребенок находится в положении на животе с роликом под эпигастрием (при Вх почечного трансплантата – на спине)

- Седация: Кетамин 0.5-1.0 мг/кг в/в, Мидазолам 0.05 мг/кг в/в

- Локализация нижнего полюса левой нативной почки или любого полюса трансплантированной почки с помощью УЗ-аппарата, маркировка места пункции

- Местная анестезия (в отмеченном месте) лидокаином с формированием туннеля для биопсийной иглы (под острым углом к капсуле почки) с помощью шприца.

- Введение биопсийной иглы в сформированный туннель (биопсийный пистолет Magnum, Gallini и др., игла диаметром 16-18 gauge длиной 20 см) под тем же острым углом для обеспечения максимального объема коркового слоя почки, содержащего клубочки, и во избежание попадания иглы в мозговой слой и лоханку (крупные сосуды и опасность кровотечения) (рис 19)

Рис. 19. Этапы биопсии почки. (Рисунки доктора Наушабаевой А.Е.)

- Забор почечной ткани (автоматически, после небольшого прокола почечной капсулы) с немедленной оценкой адекватности биоптата с помощью обычного светового микроскопа. Длина столбика должна быть более 1 см, клубочки выглядят как округлые образования красного цвета, мозговой слой в виде параллельных красных полос). Обычно 1-2 столбиков бывает достаточно.

- Помещение биоптатов в 1 пробирку, содержащую 4% забуференный формалин (берется из той патологоанатомической лаборатории, куда направляется биопсия).

- Стерильная асептическая повязка, мешок с песком на место пункции, перевод в отделение нефрологии.

После биопсии:

- 6 часов строгий постельный режим с мешком с песка на месте пункции

- Последующие 18 часов постельный режим, давящую повязку снимают через 24 часа

- Исследование каждой порции мочи на макро- и микрогематурию (тест-полоской), при кровотечении: УЗИ в отделении

- Нативная почка: Контроль АД и ЧСС: первые 2 часа каждые 15 минут, последующие 4 часа каждые 30 минут, далее каждые 1-2 часа и ночью каждые 2-3 часа. Контроль ЧД и дача кислорода пока пациент полностью проснется. Через 6 часов после Вх ОАК, при падении более чем на 2 пункта известить дежурного врача.

- Почечный трансплантат: Контроль АД и ЧСС: каждые 15 минут 2-х кратно, последующие 4 часа каждые 30 минут, далее каждые 1-2 часа и ночью каждые 2-3 часа.

- Контроль ЧД и дача кислорода, пока пациент полностью проснется

В день выписки: УЗИ почки.

Приложение 5. Возможности молекулярной генетики в диагностике различных наследственных заболеваний почек.

Наследственное заболевание почек	Ген (Omim#) / Локализация	Кодируемый белок Функция
Гломерулярные заболевания
Синдром Альпорта	Col4A5 (301050) / Xq22.3	α5 цепь коллагена 4 типа
	Col4A4 (203780) / 2q36-q37	α4 цепь коллагена 4 типа
Нефрозы	NPHS1 (602716) / 19q13.1	Нефрин
	NPHS2 (604766) / 1q25-q31	Подоцин
Тубулярные заболевания
Синдром Барттера	Bartter1 - SLC12A1 (601678) / 15q15-q21	Барттин
Bartter2 - KCNJ1 (241200) / 11q24
Цистиноз	CTNS (219800) / 17p13	Цистинозин
Цистинурия	SLC3A1 (220100) / 2p16.3	Белок-транспортер аминокислот
Болезнь Дента	CLCN5 (300008) / Xp11.22	CLCK2-хлоридный канал
Оксалоз	AGXT (259900) / 2q36-37	Аланин-глиоксилат аминотрансфераза
Нефроген. несахарный диабет	NDI1 (304800) Xq28 / NDI2 (125800) 12q13	V2- рецептор, аквапорин-2
Ренальный тубулярный ацидоз a. проксим, аутосом-домин b. дистальн, аутосом-рецесс	SLC9A1 (182307) / 5p15.3 SLC4A4 (604278) / 4q21
Кистозные заболевания
Нефронофтиз	NPHP1 (256100) / 2q13	Нефроцистин
	NPHP2 (602088) / 9q31	Инверсин
Поликистозная дегенерация почек	PKD1 (601313) / 16p13.3-p13.12	Полицистин
PKD2 (173910) / 4q21-q23	Полицистин 2
Медуллярная кистозная болезнь почек	MCKD 1(174000) 1q21 MCKD 2 (603860) 16p12
Синдромы
Опухоли Вильмса Денис-Драш	WT1 (607102) / 11p13	Zinc-Finger Транскрипционный ген
Бранхио-ото-ренальный	EYA1 (113650) / 8q13.3	?
Лоренса-Муна-Барде-Бидля	BBS1-BBS8 (209900) / 20p12, 16q21, 11q13 u.a.	BBS, функция ?
Лоу (окулоцереброренальн )	OCRL1 (309000) / Xq26.1	?
Nail-Patella	LMX1B (161200) / 9q34.1	Фактор транскрипции LIM
Болезнь Шимке	SMARCAL 1 (242900) / 2q34-q36	Регулятор хроматина, восстановление ДНК

Литература

1. Мухин Н.А., Шилов Е.М., Козловская Л.В. «Диагностика и лечение болезней почек». М, 2009.

2. Крис А. О’Каллагхан «Наглядная нефрология». М. 2009. Перевод с англ. под редакцией Е.М. Шилова

3. Джеймс А. Шейман «Патофизиология почки». М. 1999. Перевод с англ. Л.З. Певзнера. Под редакцией Ю.В. Наточина

4. Руководство по нефрологии. Под ред. Дж. А. Витворт, Дж.Р. Лоренса. Перевод с англ., Москва, 2000.

ТЕСТЫ