Репродукция и этапы взаимодействия умеренного бактериофага с бактерией
Умеренные бактериофагивзаимодействуют с бактериями либо по продуктивному, либо по интегративному типу. Продуктивный цикл умеренного фага происходит аналогично вирулентным фагам и заканчивается лизисом бактерий. При интегративном типе ДНК умеренного фага встраивается в хромосому бактерии, реплицируется синхронно с геномом бактерии, не вызывая ее лизиса (передается при делении бактерии).
ДНК фага, встроенная в хромосому бактерии, называется профагом, а культура бактерий — лизогенной. Такое сосуществование бактерии и умеренного бактериофага называется — лизогенией(от греч. lysis — разложение, genea — происхождение). Профаг, ставший частью хромосомы бактерии, при ее размножении передается по наследству потомкам.
Хромосома умеренного фага, введенная в бактерию, вызывает либо лизис, либо лизогенизацию (после проникновения в бактерию ДНК умеренного фага приобретает форму кольца, а затем интегрирует по типу кроссинговера в строго определенную гомологичную область хромосомы клетки). Профаги могут спонтанно или под действием индуцирующихагентов (УФ-лучи, митомицин С и др.) дерепрессироваться, исключаться из хромосомы. Этот процесс заканчивается продукцией фагов (индукция профага) и лизисом бактерий.
Рис. 31. Пути развития умеренного фага
Профаг придает бактерии новые свойства, что получило название фаговой (лизогенной) конверсии (лат. conversio — превращение). Конвертироваться могут морфологические, культуральные, биохимические, антигенные и другие свойства бактерий. Например, наличие профага в дифтерийной палочке обусловливает ее способность продуцировать дифтерийный экзотоксин.
Применение бактериофагов в медицине и генной инженерии
Бактериофаги применяют для профилактики, диагностики и лечения инфекционных заболеваний, в генной инженерии.
Строгая специфичность бактериофагов используется для фаготипирования, дифференцировки бактериальных культур и индикации их во внешней среде.
Фаготипирование — один из методов эпидемиологического маркирования. Применяется для выявления источника инфекции. Выделение бактерий одного фаговара от разных больных указывает на общий источник их заражения. Предварительно фаг титруется. При внутривидовой идентификации бактерий, т. е. определении фаговара (фаготипа) бактерий с помощьюфаготипирования: на чашку с плотной питательной средой, засеянную “газоном” чистой культурой возбудителя, наносят капли различных диагностических типоспецифических фагов. Бактерии, чувствительные к фагу лизируются (образуется стерильное пятно, “бляшка”, или так называемая негативная колония фага). Выпускаются наборы для фаготипирования брюшнотифозных бактерий, стафилококков, которые применяются с эпидемиологическими целями для установления источника инфекции.
По наличию фагов во внешней среде (водоемах) можно судить о содержании в них соответствующих бактерий.
Применение фагов с лечебными и профилактическими целями.
• Препараты бактериофагов применяются для лечения дизентерии, сальмонеллеза, гнойной инфекции, вызванных антибиотикорезистентными бактериями и позволяют реализовать экологический подход к лечению. В каждом случае предварительно определяют чувствительность выделенных возбудителей к данному препарату бактериофага.
• Сальмонеллезные фаги применяются для профилактики сальмонеллезов заболевания в детских коллективах. Выделяют комбинированные препараты (колипротейные, пиобактериофаги).
• Бактериофаги назначают по показаниям перорально, парентерально или местно в виде жидких, таблетированных форм, свечей или аэрозолей.
• Бактериофаги широко применяют в генной инженерии в качестве векторов для получения рекомбинантных ДНК.
III. План практической работы
1. Учесть и зарисовать демонстрацию опыта определения фаголизабельности методом стекающей капли (метод Отто) — качественный метод определения фагочувствительности бактерий.
Постановка. Готовят 2 миллиардную взвесь из исследуемой и заведомо фагочувствительной культуры бактерий и наливают по 1 мл в чашки с хорошо подсушенным мясо-пептонным агаром. Осторожно покачиванием чашек взвесь равномерно распределяют по поверхности агара, избыток отсасывают пастеровской пипеткой, посевы подсушивают в термостате и фаг наносят пастеровской пипеткой в виде стекающих капель, затем чашки со слегка приоткрытыми крышками снова помещают в термостат для подсушивания, после чего поворачивают их вверх дном. Инкубация при температуре 37ºC в течение 18-20 часов.
Учет. Результаты учитывают по наличию «стерильных» зон на месте стекания капли фага. Обширная зона лизиса культуры свидетельствует о специфическом действии фага на данную бактериальную культуру.
2. Учесть и зарисовать демонстрацию опыта определения титра бактериофага по методу Грация (количественный метод)
Постановка. Чашки с 25-30 мл 1,5% МПА тщательно высушивают и оставляют до следующего дня при комнатной температуре. Для выделения фага фильтрат разводят бульоном (1:10, 1:100, 1:1000) и в пробирку, содержащую 2,5 мл расплавленного 0,7% агара, вносят 1 мл фильтрата того или иного разведения и 0,1 мл известной чувствительной к фагу культуры бактерий. Содержимое пробирки быстро смешивают и выливают в чашки на подсушенную поверхность агара. Чашки оставляют на 30 мин. при комнатной температуре, затем помещают в термостат при 37ºC на сутки.
Учет. При наличии даже единичных корпускул фага он обнаруживается в виде отдельных негативных колоний на фоне роста культуры бактерий в виде помутнения среды, при большой концентрации — в виде сплошного лизиса бактерий. Активность (титр фага) выражают максимальным разведением, в котором проявляется литическое действие. Титр фага определяют путем подсчитывания количества негативных колоний и умножают на разведение.
Например, при исследовании по методу Грация в 1 мл фага в разведении 10-7 на чашке было обнаружено 25 колоний, следовательно, титр фага (количество корпускул в 1 мл) равен 25 ·107 — 2,5 ·108 .
3. Учесть и зарисовать опыт определения фагогруппы и фаготипа стафилококка.
Цель: установить связь между отдельными случаями заболевания, выявление источника инфекции, а также путей ее распространения.
Постановка.Суточную бульонную культуру стафилококка засевают на поверхность питательного агара методом газона. Избыток культуры удаляют и подсушивают 30-40 мин. при 37ºC. Дно засеянной чашки расчерчивают в соответствии с количеством используемых фагов (одну для определения фагогруппы, вторую — фаготипа) и в каждую часть засеянной среды в определенном порядке наносят каплю соответствующего фага. После подсыхания капель фагов чашку переворачивают и инкубируют 18-20 часов при 37ºC.
Учет. «+» результат оценивают по наличию зон лизиса в определенных квадратах на фоне сплошного роста бактерий.
Например, исследуемая культура стафилококка относится к III фагогруппе, 47 фаготипу.
IV. Примеры ситуационных задач
Ситуационная задача № 1
Типовые стафилококковые фаги применяют с целью:
1. Создания активного иммунитета
2. Создания пассивного иммунитета
3. Профилактики
4. Диагностики
5. Лечения
Теоретические вопросы для рубежного контроля знаний
1. Классификация и таксономия вирусов
2. Морфология и ультраструктура вирусов
3. Особенность строения генома вирусов
4. Этапы взаимодействия вируса с клеткой
5. Культивирование вирусов
6. Типы тканевых культур
7. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)
8. Реакция нейтрализации (РН)
9. Реакция связывания комплемента (РСК)
10. Иммуноферментный анализ (ИФА)
11. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)
12. Радиоиммунный анализ (РИА)
13. Молекулярная гибридизация (МГ)
14. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
15. Особенности строения бактериофагов
16. Репродукция бактериофагов и этапы взаимодействия вирулентного бактериофага с бактерией
17. Репродукция бактериофагов и этапы взаимодействия умеренного бактериофага с бактерией
18. Применение бактериофагов в медицине и генной инженерии
ЛИТЕРАТУРА
1. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология // М.: Мед. информ. агенство, 2002, 736 с.
2. Борисов Л.В., Кузьмин-Соколов Б.Н., Фрейдлин И.С., Федорова З.В. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии // М.: Медицина, 1994, 252 с.
3. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: Учебник / Под ред. А.А. Воробьева. — М.: Медицинское информационное агентство, 2004. — 691 с.: ил.
4. Медицинская микробиология // Под ред. В.И. Покровского, О.К. Поздеева. — Москва: ГЭОТАР-МЕД, 2001, 768 с.
5. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии // Под ред. В.В.Теца.-М.: Медицина, 2002, 352 с.
6. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии: Учебное пособие для студентов медицинских вузов / Под ред. А.А.Воробьева, А.С.Быкова — М.: Медицинское информационное агентство, 2003. — 236 с.; ил.
7. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология // Санкт-Петербург: Спец. Литература, 2000, 591 с.
8. Тимаков В.Д., Левашев В.С., Борисов Л.Б. Микробиология // М.: Медицина, 1994, 528 с.
9. Микробиология : учеб. пособие / В. В. Лысак. — Минск : БГУ, 2007. — 430 с.
10. Гурина С.В., Соколова И.П., «Микробиология», СПб, 2000 г.
11. Прозоркина Н.В., Рубашкина Л.А., «Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии», Ростов-на-Дону, 2002 г.
12. А.Н.Маянский Микробиология для врачей.- Нижний Новгород : изд — во НГМА, 1999.
13. Проблемы инфектологии / Под ред. С.В.Прозоровского.- М., 1991.
14. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак. М.: Мир, 2002.
15. Гусев, М. В. Микробиология / М. В. Гусев, Л. А. Минеева. М.: Издательский центр
16. «Академия», 2003.
17. Емцев, В. Т. Микробиология / В. Т. Емцев, Е. Н. Мишустин. М.: Дрофа, 2005.
18. Нетрусов, А.И. Практикум по микробиологии / А. И. Нетрусов [и др.]. М.: Издательский центр «Академия», 2005. — 415 с.
19. Определитель бактерий Берджи: в 2 т. / под ред. Дж. Хоулта [и др.]. М.: Мир, 1997. Т. 1–2.
20. Levinson, W. Medical Microbiology and Immunology [Text] : Examination and Board Review; the 5th Edition / W. Levinson, E. Jawetz. — Prentice-Hall International Inc., 2000. — 546p.
21. Medical Microbiology [Text] / Edited by D. Greenwod, R. Slack, J.F. Peutherer; the 16th Edition. — Churchill Livingstone, 2002. — 710 p.
22. Microbiology and infectious diseases (The National (USA) medical series for independent study) [Text] / Edited by Gabriel T. Virella; the 3rd Edition. — Williams and Wilkins, 1999. — 576 p.
23. Nester, E.W. Microbiology: A Human Perspective [Text] / E.W. Nester, C.E. Roberts, M.T. Nester. — Wm. C. Brown Publishers (WCB), 2001. — 568 p.
24. Rabson, A. Really Essential Medical Immunology [Text] / A. Rabson, I.M. Roitt, P.J. Delves; the 2nd Edition. — Blackwell Publishing, 2006. — 320 p.
25. Textbook of Microbiology [Text] / Edited by C.K.J. Paniker; the 17th Edition. — Orient Longman, 2005. — 658 p.
Интернет
26. http://www.cme.msu.edu/Bergeys/ — Bergey’s Manual Trust. Headquarters at Michigan State University.
27. http://www.microbeworld.org/home.htm — © 2002 American Society for Microbiology.
28. http://www.bact.wisc.edu/Bact303mainpage — © 2003, Dr.Kenneth T. (University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology).