Системы для биохимической идентификации бактерий

В современных условиях для изучения биохимической активности микроорганизмов, наряду с классическими варинтами “пестрого ряда”, применяют системы индикаторных бумажек (СИБ) и наборы мультимикротестов (ММТ).

Система индикаторных бумажек (СИБ) позволяет выявлять самые разнообразные ферменты бактерий. Это бумажные диски, пропитанные различными субстратами (индикатором, углеводами, аминокислотами, цитратом, ацетатом, малонатом и др. веществами). Утилизация вещества приводит к изменению рН среды, изменению цвета индикатора. Имеются наборы, которые содержат от десяти до тридцати тест-бумажек. Их можно непосредственно вносить в пробирки со взвесью бактерий либо предварительно поместить в лунки пластиковых планшетов, куда будут внесены исследуемые бактерии и уже через 3-4 часа инкубации в термостате можно судить о разложении реактивов по изменению цвета диска. Так, на практике применяют наборы Minitek Enterobacteriaceae lll и Minitek Neisseria для дифференциальной диагностики энтеробактерий (четырнадцать субстратов) и нейссерий (четыре субстрата), позволяющие получить результаты через 4 ч инкубации при 37 °С. Например, СИБы для идентификации вибрионов, энтеробактерий (Россия).

Микро-тест-системы для биохимической идентификации культур.В настоящее время, кроме классических биохимических тестов, для идентификации выделенных культур микробов применяют микро-тест-системы, которые повышают точность результатов за счет стандартизации и увеличения количества тестов (от 15 до 30), менее трудоемки и, следовательно, сокращают время исследования. Наборы мультитестов — это пластиковые планшеты, в лунки которых помещены различные субстраты и индикаторы. Стандартную взвесь исследуемой культуры вносят в лунки и инкубируют при 37°.

Тест-системы делятся на 2 группы в зависимости от содержания субстрата:

1. Системы, в которых субстрат и индикатор находится в питательной среде;

2. Системы, где субстрат и индикатор содержатся в носителе-шаблоне, например в бумажных дисках или полимерном шаблоне-носителе.

Тест-системы первой группы представляют собой полистироловые пластины с микрообъемными лунками, содержащие обезвоженные дифференциально-диагностические среды. Количество тестов в таких системах составляет около 20 и более. Для небольших лабораторий выпускаются индивидуальные тест-системы, на которых идентифицируют одну культуру. В лунки вносят суспензию испытуемой культуры в изотоническом растворе, учет проводят после 18-24 часовой инкубации. Примерами таких тест-систем являются ПБДЭ и ПБДС («Диагностические системы», Г.Н.Новгород), семейство систем API (BioMerieux, Франция), Enterotube П (Becton Dickinson, США) и др. Для крупных лабораторий с большим количеством исследуемых культур имеются коммерческие тест-системы из многорядных планшетов на 8-12 культур, содержащих до 96 лунок, например: ММТ F. 1 и ММТ Е2 («Аллерген», г. Ставрополь), ЭНТЕРО-тест 1 и 2 (Lachema, Чехия).

Инкубация тест-систем проводится в обычных термостатах или в специальных термостатируемых устройствах, входящих в комплект автоматизированных систем, где учет результатов и их интерпретация осуществляется автоматически с помощью компьютера (“Vitek”, BioMerieux, Франция).

Для тест-систем второй группы изучаемую культуру выращивают в жидких питательных средах, в которые помещают шаблон-носитель, содержащий субстрат и индикатор к изучаемому ферменту. Примером такой тест-системы является Micro-ID (Organon Teknika, США).

При необходимости ускоренной идентификации (когда лаборатории работают в круглосуточном режиме) можно использовать коммерческие рапид-системы, в которых тесты основаны не на изменении рН, а на использовании хромогенных или флюорогенных субстратов. Рапид-системы позволяют получить результаты после 4-6 часов инкубации. Примерами коммерческих рапид-систем являются API Rapid 20Е (BioMerieux, Франция), RapiD NF Plus и RapiD ANA П (IDS. США), а также RapID NH для идентификации нейссерий и гемофилов, RapID Е для энтеробактерий и др., позволяющие получить результаты не позднее 4-8 ч.

При идентификации выделенной культуры микроба определяют, чаще всего, ее видовую принадлежность, но иногда достаточно определить род или принадлежность к определенной группе. Учет результатов проводят визуально или с использованием специальных считывающих устройств — ридеров, которые повышают достоверность результатов и снижают субъективизм оценки. Каждый положительный результат оценивается знаком "+", а отрицательный — знаком. В некоторых случаях перед учетом результата теста в лунку необходимо добавить специальные проявляющие реактивы.

Фирмы, выпускающие микро-тест-системы, как правило, предлагают к тестам и «Фирменные» программы для компьютерной обработки результатов.

III. План практической работы

1. Изучить схему идентификации чистых культур бактерий

2. Изучить макроскопически и микроскопически чистоту выделенной культуры, зарисовать

3. Выполнить посевы для определения гликолитических и протеолитических свойств выделенной чистой культуры бактерий

4. Учесть результаты определения гликолитических (на средах Гисса) и протеолитических (на МПБ с индикаторными бумажками) свойств выделенных чистых культур бактерий

5. Заполнить таблицу « Дифференциально-диагностические среды»

6. Дать заключение о видовой принадлежности выделенных чистых культур бактерий (используя дифференциально-диагностическую таблицу)

7. Решить ситуационные задачи

IV. Примеры ситуационных задач

Ситуационная задача № 1

Больной Р, 35 лет, поступил в инфекционное отделение городской больницы № 1 с гнойной ангиной, предположительно стафилококковой этиологии. Какая питательная среда должна быть использована в этом случае, обоснуйте свой выбор.

Среда Эндо
ЖСА
Является дифференциально-диагностической средой и позволяет изучить биохимические свойства микроорганизмов
Является элективной питательной средой и позволяет выявить наличие лецитиназы

Ситуационная задача № 2

Больная К, 42 лет, поступила в инфекционное отделение городской больницы № 2 с подозрением на дизентерию. После выделения чистой культуры предполагаемого инфекционного агента необходимо провести биохимическую идентификацию возбудителя, для этого необходимо использовать:

Среду Эндо
Среды Гисса
МПБ или пептонную воду
Среду Левенштейна-Йенсена,

которые позволяют изучить:

антигенные свойства выделенной чистой культуры
сахаролитические (гликолитические) свойства выделенной чистой культуры
протеолитические свойства выделенной чистой культуры
фибринолитические свойства выделенной чистой культуры

Теоретические вопросы для рубежного контроля знаний

1. Состав и требования, предъявляемые к питательным средам

2. Классификация питательных сред

3. Асептики и антисептика

4. Дезинфекция, методы и контроль эффективности дезинфекции

5. Стерилизация, методы, аппаратура и режимы стерилизации

6. Методы определения эффективности стерилизации

7. Вид, штамм, колония, чистая культура микроорганизмов

8. Методы выделения чистых культур микроорганизмов

9. Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний. Цель и последовательность выполнения 1 этапа бактериологического метода выделения аэробов

10. Техника посева микроорганизмов на жидкие и плотные питательные среды

11. Особенности культивирования анаэробных микроорганизмов. Аппаратура и оборудование, используемая для культивирования анаэробных бактерий

12. Метаболизм микроорганизмов

13. Ферментные системы микроорганизмов

14. Классификация бактерий по типу питания. Источники углерода, азота, макро- и микроэлементов, ростовых факторов для микробов

15. Механизмы питания бактерий

16. Классификация микроорганизмов в зависимости от источника энергии

17. Классификация бактерий по типу дыхания — биологического окисления

18. Брожение и его виды

19. Условия культивирования бактерий

20. Рост и размножение бактерий. Фазы размножения бактерий.

21. Бактериологический метод исследования. Проведение 2 этапа бактериологического метода выделения аэробов. Культуральные свойства бактерий