Тема 3: Морфология и ультраструктура отдельных групп микроорганизмов: риккетсий, хламидий, микоплазм, актиномицет, спирохет, грибов, простейших

Цель занятия: знать морфологию и ультраструктуру риккетсий, хламидий, микоплазм, актиномицет, грибов, простейших.

уметь дать описание основным свойствам представителей микромира, использовать микроскопический метод в диагностике инфекционных заболеваний (готовить мазки из исследуемого материала, окрашивать их с помощью различных методов окраски, микроскопировать с масляной иммерсией, описывать морфологические и тинкториальные свойства)

Задание на дом:

I. Вопросы для самоподготовки:

1. Перечислить особенности строения и размножения актиномицет

2. Перечислить особенности строения, размножения риккетсий

3. Перечислить особенности строения и размножения хламидий

4. Перечислить особенности строения, выявления, химический состав микоплазм

5. Перечислить особенности строения, движения, окраски спирохет

6. Перечислить особенности строения, размножения грибов, виды мицелия, спор

7. Перечислить основных представителей патогенных простейших, их морфологические особенности, методы окраски

II. Базовый текст

Актиномицеты

Актиномицеты — это микроорганизмы, занимающие промежуточное положение между бактериями и грибами. Длительное время актиномицеты считали грибами, однако изучение морфологии и биологических свойств позволило отнести их к бактериям семейства Actinomycetaceae отдела Firmicutes. Сходство с грибами определяется способностью к образованию на питательной среде субстратного и воздушного мицелия, на концах которого образуются споры; споры актиномицет являются способом размножения. Однако, в отличие от грибов, клеточная стенка актиномицет не содержит хитина или целлюлозы; они не способны к фотосинтезу, а образуемый ими мицелий достаточно примитивен. Они также резистентны к противогрибковым препаратам. С бактериями актиномицеты объединяет отсутствие четко выраженного ядра, наличие клеточной стенки, а также чувствительность к бактериофагам и антибиотикам.

Актиномицеты — ветвящиеся, нитевидные или палочковидные грамположительные бактерии. Свое название (от греч. actis — луч, mykes — гриб) они получили в связи с образованием в пораженных тканях друз — колоний, состоящих из гранул плотно переплетенных нитей в виде лучей, отходящих от центра и заканчивающихся колбовидными утолщениями. Некислотоустойчивы. Факультативные анаэробы. Актиномицеты могут делиться путем фрагментации мицелия на клетки, похожие на палочковидные и колбовидные бактерии. Споры актиномицетов обычно нетермостойки.

Большинство актиномицет обитают на поверхности слизистых оболочек у млекопитающих; некоторые виды — почвенные сапрофиты. У человека актиномицеты колонизируют слизистые оболочки полости рта и ЖКТ. Способность вызывать специфические поражения не выражена и их рассматривают как условные патогены. Бактерии вызывают актиномикозы — хронические гнойные гранулематозные поражения различных органов.

Подавляющее большинство случаев актиномикозов у людей вызывает A.israelii, в редких случаях A.naeslundii, A.odontolyticus, A.bovis, A.viscosus.

Риккетсии и хламидии — это микроорганизмы, занимающие промежуточное положение между бактериями и вирусами. Как и вирусы, они являются облигатными внутриклеточными паразитами и могут размножаться только в клетке-хозяине. Однако, по своему строению являются мелкими грамотрицательными бактериями.

Риккетсии

Риккетсии — мелкие, грамотрицательные полиморфные бактерии (0,3-2,0 мкм), облигатные внутриклеточные паразиты. Капсул и спор не образуют. Жизненный цикл риккетсий включает две стадии — вегетативную (внутриклеточную) и покоящуюся. Вегетативные формы активно размножаются бинарным делением в цитоплазме, а некоторые — в ядре инфицированных клеток, используя энергетические системы клетки-хозяина, поскольку не способны синтезировать кофермент НАД и др. метаболиты. Покоящаяся форма обладает повышенной резистентностью с утолщенной клеточной стенкой и уплотненной цитоплазмой.

Обитают в организме членистоногих (вшей, блох, клещей), которые являются их хозяевами или переносчиками. Форма и размер риккетсий могут меняться (клетки неправильной формы, нитевидные, кокковидные, бациллярные) в зависимости от условий роста. В мазках и тканях их окрашивают по Романовскому-Гимзе, по Здродовскому или по Маккиавелло (риккетсии красного цвета, а инфицированные клетки — синего).

Таксономия риккетсийосновывается на сравнении фенотипических, в том числе антигенных характеристик, клинико-эпидемиологических особенностях болезней, а также молекулярно-генетических данных, присущих отдельным представителям риккетсий. До недавнего времени семейство риккетсии включало роды Rickettsia, Orientia, Ehrlichia и Coxiella. По современной классификации (Е. П. Лукин, А. А. Воробьев, А. С. Быков, 2001), семейство Rickettsiaceae относится к классу Alphaproteobacteria (альфа-1 протеобактерии) и включает три рода: Rickettsia, Orientia, и Ehrlichia. Род Coxiella исключен из семейства Rickettsiaceae и отнесен к гамма-протеобактериям (близкое родство к легионеллам).

Патогенные для человека риккетсии вызывают риккетсиозы; среди них выделяют группы сыпных тифов (R.prowazekii, R.typhi) и пятнистых лихорадок (R.ricketsii, R.conorii), Ку-лихорадку (C.burnetii) и др.

Хламидии

Хламидии относятся к облигатным внутриклеточным кокковидным грамотрицательным (иногда грамвариабельным) бактериям. Они размножаются только в живых клетках. Вне клеток хламидии имеют сферическую форму (0,3 мкм), метаболически неактивны и называются элементарными тельцами. В клеточной стенке элементарных телец имеется главный белок наружной мембраны и белок, содержащий большое количество цистеина. Элементарные тельца попадают в эпителиальную клетку путем эндоцитоза с формированием внутриклеточной вакуоли. Внутри клеток они увеличиваются и превращаются в делящиеся ретикулярные тельца, образуя скопления в вакуолях (включения). Из ретикулярных телец образуются элементарные тельца, которые выходят из клеток путем экзоцитоза или лизиса клетки. Вышедшие из клетки элементарные тельца вступают в новый цикл, инфицируя другие клетки.

Согласно последним данным семейство Chlamydiaceae включает два рода: собственно Chlamydia и новый род Chlamydophila; в последний входят виды C.pecorum, C.pneumonia и C.psittaci. Род Chlamydia включает, кроме C.trachomatis, два новых вида: C.muridarum и C.suis, выделенных соответственно от мышей, золотистых хомячков и от свиней.

Изучают хламидии в живом состоянии с использованием фазово-контрастной микроскопии и окрашивают по методу Романовского-Гимзы (элементарные тельца окрашиваются в розовый, ретикулярные — в сине-голубой цвет), а также в реакции иммунофлюоресценции (РИФ) и с помощью генетических методов (ПЦР).

У человека вызывают хламидиозы: C.trachomatis (возбудитель трахомы, урогенитальных инфекций), C.psittaci (орнитоз), C.pneumoniae (различные формы респираторных инфекций).

Микоплазмы

Микоплазмы — мелкие полиморфные микроорганизмы (0,15-1,0 мкм), лишенные клеточной стенки и относящиеся к классу Mollicutes. Поверхностной оболочкой микоплазм является цитоплазматическая мембрана, но более прочная и эластичная, что связано с присутствием в ней холестерина. Большинство видов микоплазм нуждается в экзогенном холестерине или других стеринах для роста. Клетки микоплазм содержат нуклеоид (геном микоплазм является самым маленьким среди всех саморепродуцирующихся живых клеток), рибосомы, цитоплазму и цитоплазматическую мембрану. Иногда вокруг крупных морфологических элементов в электронном микроскопе виден мукозный слой, подобный капсуле. У некоторых микоплазм обнаружены микроворсинки и нитчатые или стеблеобразные выросты различной длины, которые принимают участие в скользящем движении клеток и адгезии. У микоплазм наблюдаются различные способы размножения: бинарное деление, фрагментация крупных тел и нитей с образованием мелких зерен, процесс, сходный с почкованием. Из-за отсутствия клеточной стенки микоплазмы осмотически чувствительны. Имеют разнообразную форму: кокковидную, нитевидную, колбовидную; похожи на L-формы. На плотной питательной среде образуют колонии, напоминающие яичницу-глазунью: центральная непрозрачная часть, погруженная в среду, и более прозрачная периферия в виде круга.

Микоплазмы являются «мембранными паразитами», в основном поражают слизистые оболочки, где отсутствуют микробы-антагонисты. Они прочно прикрепляются к мембране клеток, усваивая из мембраны необходимые им питательные вещества, эпителиоциты при этом повреждаются, но не погибают. Микоплазмы изучают в нативных препаратах с использованием фазово-контрастной микроскопии, РИФ и генетических методов (ПЦР).

У человека микоплазмы вызывают микоплазмозы: M.pneumoniae (заболевания респираторного тракта), M.hominis, M.genitalium, U.urealyticum (инфекции урогенитального тракта).

Спирохеты

Спирохеты — тонкие, длинные, извитые (спиралевидной формы) бактерии, отличающиеся от спирилл подвижностью, обусловленной сгибательными изменениями клеток. Спирохеты имеют наружную мембрану клеточной стенки, окружающую протоплазматический цилиндр с цитоплазматической мембраной. Под наружной мембраной клеточной стенки (в периплазме) расположены периплазматические фибриллы, которые, как бы закручиваясь вокруг протоплазматического цилиндра спирохеты, придают ей винтообразную форму (первичные завитки спирохет). Фибриллы прикреплены к концам клетки и направлены навстречу друг другу. Другой конец фибрилл свободен. Число и расположение фибрилл варьирует у разных видов. Фибриллы участвуют в передвижении спирохет, придавая клеткам вращательное, сгибательное и поступательное движение (рис.7). При этом спирохеты образуют петли, завитки, изгибы, которые названы вторичными завитками.

Тема 3: Морфология и ультраструктура отдельных групп микроорганизмов: риккетсий, хламидий, микоплазм, актиномицет, спирохет, грибов, простейших - student2.ru

Внешняя мембрана Аксиальная фибрилла Периплазматическое пространство Пептидогликан Цитоплазматическая мембрана

Рис. 7. Двигательный аппарат спирохет

Спирохеты плохо воспринимают красители из-за большого количества липидов в оболочке. Их окрашивают по методу Романовского-Гимзы или серебрением, а в живом виде исследуют с помощью фазово-контрастной или темнопольной микроскопии. Спирохеты представлены тремя родами, патогенными для человека: Treponema, Borrelia, Leptospira.

Трепонемы (род Treponema, вид T.pallidum, возбудитель сифилиса) имеют вид тонких штопорообразно закрученных нитей с 8-12 равномерными мелкими завитками. Вокруг протопласта трепонем расположены фибриллы. Окрашиваются в бледно-розовый цвет по методу Романовского-Гимзы.

Боррелии (род Borrelia, B.recurrentis, возбудитель возвратного тифа) более длинные, имеют по 3-8 крупных неравномерных завитков и 8-20 фибрилл. Окрашиваются в сине-фиолетовый цвет по методу Романовского-Гимзы.

Лептоспиры (род Leptospira, вид L.interrogans, возбудитель лептоспироза) имеют завитки неглубокие и частые — в виде закрученной веревки (завитки первого порядка). Концы этих спирохет изогнуты наподобие крючков с утолщениями на концах. Образуя вторичные завитки, они приобретают вид букв "S" или "С"; имеют две осевые нити. Окрашиваются в красно-розовый цвет по методу Романовского-Гимзы.

Таблица 7. Дифференциальные признаки спирохет

Номенклатура	Инфекционное заболевание	Размеры, кол-во и характер завитков	Метод Романовского-Гимзы (цвет)
Род Borrelia Вид B.recurrentis	Возвратный тиф	3-8 крупных неравномерных завитков	сине-фиолетовый
Род Treponema Вид T.pallidum	Сифилис	8-12 равномерных мелких завитков	бледно-розовый
Род Leptospira Вид L.interrogans	Лептоспироз	Неглубокие частые завитки 1-го и завитки 2-го порядка, придающие бактерии форму букв "S" или "С"	красно-розовый

Грибы

Грибы — это эукариоты, относящиеся к царству Fungi (Mycetes, Mycota). Это многоклеточные или одноклеточные нефотосинтезирующие (бесхлорофильные) микроорганизмы с клеточной стенкой. Они широко распространены в природе, особенно в почве.

Грибы имеют ядро с ядерной оболочкой, цитоплазму с органеллами, цитоплазматическую мембрану и многослойную ригидную клеточную стенку, состоящую из нескольких типов полисахаридов (маннанов, глюканов, целлюлозы, хитина), а также белка, липидов и др. Некоторые грибы образуют капсулу. Цитоплазматическая мембрана содержит гликопротеины, фосфолипиды и эргостеролы (в отличие от холестерина — главного стерола тканей млекопитающих). Грибы являются грамположительными микробами, вегетативные клетки — некислотоустойчивые. Тело гриба называется талломом. Различают два основных типа грибов: гифальный и дрожжевой.

Гифальные (плесневые грибы) образуют ветвящиеся тонкие нити (гифы). Гифы (от греч. hypha, паутина) представляют собой разветвленные микроскопические трубки диаметром 2-10 мкм, содержащие цитоплазму и органеллы. Совокупность гиф обозначают термином мицелий (от греч. mykes — гриб и helos — нарост). Образование мицелия — отличительный признак истинных грибов (Eumycota). Гифы высших грибов содержат перегородки (септы), разделяющие их на отдельные клетки. Септы имеют отверстия, позволяющие цитоплазме и отдельным органеллам перетекать из одной клетки в другую. Гифы низших грибов не имеют перегородок и называются ценоцитными, или асептированными. Таким образом, плесневый гриб представляет собой ценоцит (от греч. koinos — общий и kytos — клетка) — обширную территорию цитоплазмы с множеством ядер, располагающуюся в скоплении трубок-гиф. Врастающая в субстрат часть тела гриба, абсорбирующая питательные вещества — это вегетативный мицелий, а растущая на поверхности субстрата часть — воздушный мицелий. Воздушный мицелий придает поверхности колоний плесневых грибов характерную шерстистую или пушистую фактуру. Нередко воздушный мицелий образуют специализированные гифы, несущие репродуктивные структуры.

Таблица 8. Грибы, имеющие медицинское значение

Таксоны	Основные роды	Болезни людей
Зигомицеты (тип Zygomycota) Низшие грибы (имеют несептированный мицелий, размножение половое и бесполое)	Mucor, Rhizopus, Rhizomucor	Зигомикоз (мукоромикоз)
Аскомицеты (тип Ascomycota) Сумчатые грибы, большинство имеют септированный мицелий	Дрожжи: Saccharomyces.	Многочисленные микозы
Arthroderma (Trichophyton, Microsporum)	Дерматомикозы
Aspergillus, Penicillium	Аспергиллез, пенициллоз
Базидиомицеты (тип Basidiomycota)	Дрожжи: Filobasidiella (Cryptococcus neoformans)	Криптококкоз
Дейтеромицеты (формальная группа Deiteromycota)	Несовершенные дрожжи: Candida, Cryptococcus, Trichosporon	Кандидозы, криптококкоз
Coccidioides (C.immitis)	Кокцидоидомикоз

Дрожжевые грибы. Дрожжи и дрожжевые грибы представлены отдельными овальными клетками размером 3-10 мкм, морфологически сходными между собой. При бесполом размножении дрожжи образуют почки или делятся, что приводит к одноклеточному росту. Могут образовывать псевдогифы и ложный мицелий (псевдомицелий), состоящий из цепочек удлиненных клеток. Грибы, аналогичные дрожжам, но не имеющие полового способа размножения, называются дрожжевыми. Они размножаются только бесполым способом — почкованием или делением. На питательных средах дрожжи и дрожжевые грибы образуют блестящие, выпуклые колонии, сходные с колониями бактерий. Многие грибы обладают диморфизмом — способностью давать мицелиальный или дрожжеподобный рост в зависимости от различных факторов (например, условий культивирования).

У грибов выделяют половой и бесполый типы размножения. Бесполое размножение реализуется путем образования конидий и спорангиоспор, содержащих весь генетический материал, необходимый для возникновения и развития новой колонии. Конидии — неполовые репродуктивные структуры. Они могут быть одноклеточными (микроконидии) и многоклеточными (макроконидии). У некоторых грибов конидии формируются на концах конидионосных гиф — конидиофоров (бластоконидии), у других — по бокам и на концах обычных гиф (таллоконидии) путем их септирования и расчленения. Бластоспоры формируются путем отпочковывания от конидиофора, что характерно для дрожжей и дрожжевых грибов. Наиболее типичные таллоконидии — артроконидии и хламидоконидии. Артроконидии (артроспоры) образуются в результате фрагментации септированных гиф, распадающихся на отдельные клетки. Хламидоконидии (хламидоспоры) образуются внутри нитей мицелия в виде увеличенных клеток, окруженных толстой оболочкой. За счет плотной оболочки хламидоконидии приобретают устойчивость к различным воздействиям и сохраняются после гибели и распада мицелия (рис.8).

Спорангиоспоры — споры, образующиеся вегетативным путем в специализированных мешках (спорангиях). Последние располагаются на концах особых гиф — спорангиофорах. К основным типам спорангиев относятся фиалиды (образования в форме бокала), и аннелиды (кольцевидные структуры). Половым путем образуются аскоспоры, базидиоспоры и зигоспоры.

Среди грибов, имеющих медицинское значение, выделяют три типа (Phylum) или отдела, имеющие половой способ размножения (совершенные грибы): зигомицеты (Zygomycota), аскомицеты (Askomycota) и базидиомицеты (Basidiomycota). Кроме того, выделяют условный тип/группу грибов — дейтеромицеты (Deiteromycota), у которых имеется только бесполый способ размножения (несовершенные грибы).

Рис. 8 Способы размножения грибов

7. Простейшие

Простейшие или протисты (Protozoa), состоят из единственной эукариотической клетки. Снаружи тело простейших покрывает ригидная мембрана — пелликула. К ней прилегает внешний более плотный и гомогенный слой цитоплазмы — эктоплазма. У некоторых видов пелликула может содержать опорные фибриллы и даже минеральный скелет. Набор органелл, расположенных в более жидкой эндоплазме, идентичен клеткам многоклеточных животных организмов; исключением может быть наличие у некоторых видов нескольких ядер. Многие простейшие способны активно передвигаться за счет псевдоподий (выростов цитоплазмы), жгутиков и ресничек. В неблагоприятных условиях простейшие могут образовывать цисты.

Простейшие разных классов могут вызывать различные инфекционные заболевания (табл. 8). В последнее десятилетие резко возросло значение простейших — латентных паразитов организма человека, которые активизируются при снижении иммунной реактивности (врожденные и приобретенные иммунодефициты). К ним относятся возбудители токсоплазмоза, пневмоцистоза и др. Трихомонада является одним из наиболее распространенных возбудителей инфекций урогенитального тракта. Для идентификации с помощью световой микроскопии используют окраску по Романовскому-Гимзы (цитоплазма окрашивается в синий, ядро — в красный цвет).

Таблица 9. Простейшие, имеющие медицинское значение

Таксоны	Представители	Нозологические формы
Тип Sarcomastigophorae
Подтип Sarcodina (Саркодовые)	Entamoeba hystolyticum	Амебиаз (амебная дизентерия)
Подтип Mastigophora (Жгутиконосцы)	Лейшмании Leishmania spp	Лейшманиозы
Трипаносомы Trypanosoma brucei	Африканский трипаносомоз
Лямблии Giardia lamblia	Лямблиоз (диарея, мальабсорбция)
Трихомонады Trychomonas vaginalis	Трихомоноз (вагиниты, уретриты, простатиты)
Тип Apicomplexa
Класс Sporozoa (Споровики)	Плазмодии P.ovale, P.vivax, P.malariae	Малярия
Токсоплазмы Toxoplasma gondii	Токсоплазмоз
Тип Ciliophora
Класс Kinetofragminophorea	Балантидии Balantidium coli	Балантидиазная дизентерия
Тип Microspora
Класс Microsporea	Микроспоридии Enterocytozoon spp.	Микроспоридиоз

III. План практической работы

1. Зарисовать с таблиц строение актиномицет, хламидий, микоплазм, риккетсий.

2. Микроскопировать готовые препараты плесневых грибов рода Mucor, зарисовать.

3. Заполнить таблицу «Дифференциальные признаки спирохет».

4. Решить практическую ситуационную задачу: провести микроскопическое исследование предложенного материала, идентифицировать микроорганизмы на основании изучения морфологических и тинкториальных свойств (окраска по Граму и Цилю-Нильсену), дать заключение.

IV. Примеры ситуационных задач

Ситуационная задача № 1

Выберите специальные методы окраски, используемые при проведении микроскопического исследования при риккетсиозах:

1. Метод Грама

2. Метод Здродовского

3. Метод Циля-Нильсена

4. Метод Романовского-Гимзы

5. Метод Бурри-Гинса

Ситуационная задача № 2

На слизистой оболочке полости рта новорожденного отмечается гиперемия и наличие белого творожистого налета. Взят мазок и окрашен по методу Грама. В мазке обнаружены крупные (7-10 мкм) грамположительные овально-округлые клетки, располагающиеся неправильными группами. Дайте заключение:

1. В исследуемом материале обнаружены микроорганизмы рода Streptococcus

2. В исследуемом материале обнаружены микроорганизмы рода Candida

3. В исследуемом материале обнаружены микроорганизмы рода Staphylococcus

4. В исследуемом материале обнаружены микроорганизмы рода Clostridium

Ситуационная задача № 3

У больного с подозрением на возвратный тиф в начале приступа лихорадки взята кровь, приготовлен мазок и окрашен по методу Романовскому-Гимзы. Опишите характерные морфологические и тинкториальные свойства предполагаемого возбудителя:

1. Одиночная извитая бактерия, синего цвета, имеющая 3-8 крупных неравномерных завитков

2. Одиночная извитая бактерия, бледно-розового цвета, имеющая 8-12 равномерных мелких завитков

3. Одиночная извитая бактерия, красно-розового цвета, имеющая неглубокие частые завитки 1-го и завитки 2-го порядка, придающие бактерии форму букв "S" или "С"

4. Грамположительные кокки, располагающиеся цепочкой

Ситуационная задача № 4

У больного с подозрением на сифилис приготовлен мазок из отделяемого твердого шанкра и окрашен по методу Романовскому-Гимзы. Опишите характерные морфологические и тинкториальные свойства предполагаемого возбудителя: