Изучить характер роста дифтерийной палочки на среде Клауберга. Описать культуральные свойства колоний, зарисовать.

Среда Клауберга предназначена для культивирования C.diphtheriae и состоит из питательного агара, раствора тел­лурита калия, глицерина, гемолизированной крови. Через 24 часа инкубации на плотной питательной среде вырастают матово-черные, неслившиеся плоские колонии. Че­рез 48-72 часа возможна их дифференциация на биотипы. Тип gravis образует матовые серовато-черные крупные колонии с несколько изрезан­ными краями («цветы маргаритки»), колонии типа mitis растут в виде мелких блестя­щих серовато-черных колоний с ровными краями.

8. Заполнить таблицу: «Дифференциальные признаки C. diphtheriae и некоторых других видов коринебактерий, выделяемых со слизистых дыхательныхпутей человека».

9. Изучить технику постановки и учесть реакцию преципитации (РП) в геле с целью определения токсигенности дифтерийной палочки (РН токсина антитоксической сывороткой).

Токсигенность определя­ют с помощью двойной диффузии в геле (метод Оухтерлони). Для постановки реакции преципитации в геле по Оухтерлони берут чашки Петри с фосфатно-пептонным агаром. На поверхность питательной среды помещают стерильную полоску фильтровальной бумаги (2,0x8 см), смоченную стандартной антитоксической противо­дифтерийной сывороткой, содержащей 500 МЕ/мл. По обеим сторо­нам бумажки на расстоянии 0,5-1 см от нее симметрично засевают испытуемые дифтерийные культуры бляшками или штрихами. Контроли: посев заведомо нетоксигенной и токсигенной культур. Результа­ты учитывают через 24, 48 и 72 часа инкубации при 37°С. Если культура токсигенна, то между полоской бумаги и ростом культуры образуются белые линии преципитации в результате встречной диффузии анти­токсина и токсина. Образующиеся дугообразные линии вокруг исследуемой колонии, со­впадающие с линией преципитата контрольной токсигенной культуры, являются положительным результатом реакции.

Решение ситуационных задач.

Ситуационная задача

В больницу поступил ребенок 8-и лет с температурой 39°С, болью в горле и удушьем. Во время осмотра в области зева отмечается налет в виде плохо отслаивающейся пленки желтоватого оттенка. При микробиологическом исследовании пленки выявлены прямые грамположительные палочки с утолщением на концах, располагающиеся под углом к другу; спор и капсул не образуют. На среде Клауберга микроорганизмы растут в виде крупных сухих, серых колоний с изрезанными краями («цветы маргаритки»). Обладает выраженной биохимической активностью: ферментирует глюкозу, мальтозу, крахмал, гликоген, продуцируют цистиназу.

1. Какие из перечисленных микроорганизмов выделены от больного:

1. Corynebacterium diphtheriae mitis

2. Corynebacterium diphtheriae gravis

3. Mycobacterium tuberculosis

4. Bordetella pertussis

5. Clostridium perfringens

2. Какие методы следует использовать для окрашивания выделенного возбудителя:

1. Циля-Нильсена

2. Нейссера

3. Леффлера

4. Ожешко

5. Бурри-Гинса

3. Токсигенность дифтерийной палочки определяют с помощью реакции:

1. Агглютинации

2. Преципитации

3. Связывания комплемента

4. ИФА

5. ПЦР

Модуль IV «Воздушно-капельные инфекции»

Тема 2: Микробиологическая диагностика воздушно-капельных инфекций: менингококковая инфекция, коклюш

Цель занятия: знатьклассификацию и основные биологические свойства, факторы патогенности возбудителей, методы микробиологической диагностики, биопрепараты для этиотропной терапии и специфической профилактики указанных инфекций.

уметьмикроскопироватьс масляной иммерсией микропрепараты, описывать морфологические и тинкториальные свойства бактерий; учитывать результаты РПГА с парными сыворотками; учитывать результаты РСК.

Задание на дом:

I. Вопросы для самоподготовки:

1) Характеристика биологических свойств и особенностей микробиологической диагностики возбудителей менингококковой инфекции

2) Характеристика биологических свойств и особенностей микробиологической диагностики возбудителей коклюша

II. Базовый текст

Возбудители менингита

1. Классификация и таксономия

Менингококковая инфекция — острая респираторная инфекция, вызываемая менингококком -Neisseria meningitidis. Клинически характеризуется поражением слизистой оболочки носоглотки (назофарингит), генерализацией в форме специфической септицемии (менингококцемия) и воспалением мягких мозговых оболочек (менингит).

Neisseria meningitidis относится к домену Bacteria, типу Proteobacteria, классу Betaproteobacteria, порядку Neisseriales, семейству Neisseriaceae, роду Neisseria.

2. Нозологичекие формы

N. meningitidis вызывает менингококковый менингит (эпидемичес­кий цереброспинальный менингит).

Остальные представители этого рода (кроме N. gonorrhoeae) являются резидент­ной флорой слизистых оболочек.

3. Эпидемиология и пути передачи

Менингококковая инфекция — строгий антропоноз с воздушно-капельной передачей возбудителя. Основной источник менингококков — носители, но наиболее опасны больные с признаками генерализованных поражений. Менингококковая инфекция распространена повсеместно. Распространение возбудителя на территории, где заболевание ранее не регистрировали (например, регионы Крайнего Севера), приводит к преобладанию генерализованных форм, охватывающих все возрастные группы.

Природный резервуар менингококка — носоглотка человека. N. meningitidis выделяют у 3-30% здоровых людей. Одновременно с ростом числа носителей, невосприимчивых к менингококкам, увеличивается количество людей, выполняющих роль резервуара возбудителя. Во время эпидемии уровень носительства приближается к 95%, однако заболевание развивается у менее 1% инфицированных лиц.

На слизистой оболочке носоглотки обнаруживаются непатогепные представители рода — N. сatarrhalis, N. sicca.

4. Морфология и тинкториальные свойства

Менингококки — мел­кие (0,6—0,8 мкм) диплококки. Для них характерно располо­жение в виде пары кофейных зерен, обращенных вогнутыми поверхностями друг к другу. Менингококки не­подвижны, спор не образуют, имеют пили, грамотрицательны, в мазках из патологического материала выявляется нежная капсула.

5. Питательные среды и культуральные свойства

Менингококки выращиваются в аэробных условиях, на средах, содержащих нативный белок животного или человеческого происхождения. На плотной среде (сывороточный агар, кровяной агар и др.) менингококки образуют мелкие прозрачные колонии с ровными краями, вязкой консистенции. Растут на искусственных питательных средах, содержащих спе­циальный набор аминокислот. Элективная среда должна содер­жать ристомицин — кровяной агар с ристомицином — питательный агар на основе бульона Хоттингера + 20% сыворотки крови (лошадиной или бычьей) + раствор мальтозы + раствор водного голубого + ристомицин (150 ед/мл среды). Рост колоний наблюдается через 48 часов. Колонии мелкие, с булавочную головку, с ровными края­ми, прозрачные, голубоватого оттенка. Повышенная концентрация СО₂ в атмосфере стимулирует рост менингококков. Они очень требовательны к условиям культивирования: температурный оптимум 37°С (повышение до 39°С или снижение до 14°С вызывает гибель).

6. Антигенная структура

Менингококки содержат протеиновый антиген, общий для всего вида, и полисахарид, различная структура которого дала возможность подразделять их на серогруппы и серовары. На основе группоспецифических полисахаридных капсульных антигенов выделяют 13 серогрупп. Наи­более часто вызывают менингококковую инфекцию представители серогрупп А, В, С, X, Y и W-135.

7. Биохимические свойства

Менингококки ферментируют с образованием кислых продуктов только глюкозу и мальтозу, что служит дифференциально-диагностическим признаком.

8. Факторы патогенности

Менингококки обладают адгезивными, токсическими, инвазивными и антифагоцитарными свойствами.

1. Факторы адгезии — пили и белки наружной мембраны клеточ­ной стенки.

2. Инвазию менингококков обуславливают ферменты — гиалуронидаза, протеаза, фибринолизин, нейраминидаза. Протеаза раз­рушает sIgA, обеспечивающий местный иммунитет на слизистый носоглотки.

3. Основной токсический фактор — это эндотоксин, освобождаю­щийся при гибели менингококков и обладающий пирогенным, некротическим и летальным действием. Некоторые штаммы менингококков продуцируют гемолизин.

4. Антифагоцитарныей фактор — это полисахаридная капсула ме­нингококков, которая защищает N.meningitidis от гибели в ваку­олях фагоцитов, где менингококки беспрепятственно размножаются, как в "инкубаторе", вызывая генерализацию про­цесса при последующем разрушении фагоцитов. Плазмокоагулаза, вырабатываемая менингококками, также об­ладает антифагоцитарной активностью.

9. Патогенез

Входные ворота инфекции — слизистая оболочка заднего отдела носоглотки. Менингококки имеют пили, посредством которых они вза­имодействуют со специфическими рецепторами эпителия, наступает адгезия и последующая колонизация цилиндрического эпителия, со­провождающаяся воспалительной реакцией.

При прорыве защитного барьера слизистой оболочки, чему способ­ствуют ферменты гиалуронидаза и нейраминидаза, возбудитель прони­кает в лимфатические сосуды и далее в кровь. Развивается менингококцемия. Происходит массовая гибель менингококков с освобождением большого количества эндотоксина. Эндотоксин поражает эндотелий кро­веносных сосудов, возникают множественные кровоизлияния в различ­ные ткани и органы, на коже появляется геморрагическая сыпь.

Может развиться инфекционно-токсический шок, сопровождаю­щийся расстройством гемодинамики, тромбозом и диссеминированной внутрисосудистой коагуляцией, резкими изменениями в электролитном и гормональном гомеостазе. Такие тяжелые пораже­ния возникают при молниеносной менингококцемии, нередко закан­чивающейся гибелью больного.

При прорыве гематоэнцефалического барьера менингококки ге­матогенным путем попадают в субарахноидальное пространство, где они размножаются, вызывая серозно-гнойное, переходящее в гнойное, воспаление мягких мозговых оболочек — менингит. Иногда в воспали­тельный процесс вовлекается мозговое вещество — развивается менингоэнцефалит.

Различают следующие клинические формы менингококковой инфекции:

1. локализованные: менингококконосительство, острый назофарингит;

2. генерализованные:

а) менингококцемия (типичная, молниеносная, хроническая);

б) менингит;

в) менингоэнцефалит;

г) смешанная (менингококцемия + менингит, в 25-50% случаев);

д) редкие формы (эндокардит, артрит, пневмония, иридоциклит и др.)

Многообразие клинических форм обусловлено, по-видимому, степенью вирулентности штаммов N.meningitidis и резистентностью организма человека. Действие β-лактамных лекарственных препаратов на менинго­кокки приводит к формированию L-форм возбудителя, теряющих спе­цифические морфологические, физиологические и антигенные особенности, присущие исходным клеткам. Выделяют L-формы из ликвора больных.

10. Иммунитет

Антитела к менингококковым антигенам появляются на 5-й день болезни, их пик выявляется на 2-3-й неделе от начала заболевания. Постинфекционный иммунитет — напряженный, длительный, повтор­ные заболевания и рецидивы возникают редко. Иммунитет носит гуморальный характер. Антитела вырабатываются к различным анти­генам микробной клетки (полисахаридам и белкам). Полисахаридные антигены сероваров А и С обладают высокой иммуногенностыо, полисахарид серовара В почти неиммуногенен.

Противоменингококковые антитела передаются трансплацентарно от матери плоду и сохраняются на протяжении 2-5 месяцев после рождения ребенка.

11. Методы лабораторной диагностики

Осуществляется бактериоскопическим, бактериологическим, серологическим методами. Применяются и экспресс-методы диагнос­тики.

Материалы для исследования: слизь из носоглотки, спинномоз­говая жидкость (ликвор), кровь. Ликвор получают с помощью спин­номозговой пункции. При менингите ликвор вытекает из иглы струей (а не каплями, как в норме) и обычно бывает мутным. Носоглоточную слизь берут с задней стенки глотки специальным заднеглоточным там­поном на длинной изогнутой проволоке, не касаясь слизистой полос­ти рта, языка и зубов.

Менингококки во взятых материалах быстро погибают, особен­но при охлаждении, поэтому исследуемые материалы хранят до посе­ва не более 2-3 часов при 37°С.

1. Бактериоскопическому исследованию подвергают ликвор (луч­ше брать осадок после центрифугирования) и секционный материал (оболочки мозга). Из исследуемого материала готовят мазки, окраши­вают метиленовым синим или методом Грама. При положительном результате в поле зрения видны лейкоциты и диплококки в виде "ко­фейных зерен", расположенные как внеклеточно, так и внутри лейко­цитов. По Граму менингококки окрашиваются в розовый цвет, т.к. они грамотрицательны.

2. Бактериологический метод диагностики является основным. Он заключается в выделении и последующей идентификации возбу­дителя из носоглоточной слизи, ликвора, крови, геморрагических вы­сыпаний. Посевы осуществляют на плотные питательные среды., которые готовятся на основе бульона Хоттингера (или другого высококачественного бульона) с добавлением крови, сыворотки крови или асцитической жидкости. В среду добавляют для подавления роста сопутствующей микрофлоры антибиотик ристомицин, к которому менингококки устойчивы.

Исследуемую кровь в объеме 5-10 мл сначала засевают в колбу с 50 мл 0,1% МПА (полужидким) и инкубируют при 37°С 24 часа, затем пересевают на плотную питательную среду.

Далее проводят макро-и микроскопическое исследование вырос­ших колоний и выделяют чистую культуру на скошенном сыовороточном или кровяном агаре (параллельно колонии засевают на обычный скошенный агар, на котором менингококки не должны расти).

Идентификация проводится по антигенным свойствам (в реак­ции агглютинации на стекле) для определения серогруппы и биохи­мической активности (N.meningitidis биохимически малоактивна, разлагает с образованием кислоты без газа глюкозу и мальтозу, не фер­ментирует левулезу, сахарозу, лактозу, не образует индол и H₂S).

3. Серологический метод используют как для выявления менингококкового антигена в исследуемых материалах, так и для обнаруже­ния противоменингококковых антител в сыворотке крови больного. Применяют следующие серологические реакции — РИГА, РСК, ИФА. РИФ, встречный иммуноэлектрофорез.

4. Экспресс-диагностику проводят с помощью реакций коагглютинации и латекс-агглютинации. Обе реакции применяют для выявле­ния как N. meningitidis (в том числе и нежизнеспособных), так и их антигенов.

В реакции коагглютинации специфические противоменингококковые антитела сорбированы на клетках стафилококков, содержащих А-белок, который обладает способностью присоединять Fc-фрагмент IgG антител.

В реакции латекс-агглютинации специфические антитела связаны с час­тицами латекса.

И коагглютинацию, и латекс-агглютинацию ставят на предмет­ных стеклах, добавляя исследуемый материал (чаще всего ликвор) к специфическим противоменингококковым сывороткам. Видимый результат — агглютинация — наступает через 15-30 минут в виде обра­зования хлопьев.

Латекс-агглютинацию можно ставить и для обнаружения проти­воменингококковых антител в исследуемых сыворотках. В этом слу­чае используется частицы латекса с сорбированным на них менингококковым антигеном.

12. Лечение и профилактика

Осуществляется инактивированной химической вакциной, содер­жащей высокоочищенные капсульные полисахариды серогрупп А, С, Y, W-135, каждый из которых формирует лишь групповой иммунитет.

1). Вакцина менингококковая группы А полисахаридная сухая — очи­щенный капсульный специфический полисахарид, выделенный из бульонной культуры менингококка. Препарат предназначен для профи­лактики менингококковой инфекции, вызванный менингококком серогруппы А у детей и взрослых (по эпидемиологическим показаниям).

2). Вакцина менингококковая групп АиС полисахаридная сухая — аналогична предыдущей. Предназначена для профилактики менинго­кокковой инфекции, вызванной менингококками серогрупп АиС,с 18-летнего возраста по эпидемиологическим показаниям.

3). Иммуноглобулин человека нормальный — иммуноглобулиновая фракция сыворотки человека (серия — от 1000 чел.), очищенная и кон­центрированная методом фракционирования этиловым спиртом, со­держит антитела различной специфичности. Предназначена для экстренной профилактики и лечения в первые дни заболевания при различных заболеваниях менингококковой инфекции, коклюша, а так­же кори, гепатита В и др. Препарат применяют в первую очередь у детей с тяжелыми формами заболеваний.

Для лечения применяют сульфаниламиды и антибиотики. При генерализованных формах менингококковой инфекции эффективной является пенициллинотерапия большими дозами.

Возбудители коклюша

1. Классификация и таксономия

Кокл́юш — острое респираторное инфекционное заболевание, ха­рактеризующееся затяжным течением и наличием судорожного при­ступообразного кашля.

Возбудителем коклюша является Bordetella pertussis, который относится к домену Bacteria, типу Proteobacteria, классу Betaproteobacteria, семейству Alcaligenaceae, роду Bordetella.

2. Нозологичекие формы

Возбудители рода Bordetella патогенны для человека. B. pertussis вызывает коклюш, возбудителем паракоклюша является B.parapertussis.

3. Эпидемиология и пути передачи

Единственный источник инфекции — человек, больной коклюшем (заразен до 25-30 дней) или бактерионоситель. Механизм передачи — аэрозольный; путь передачи — воздушно-капельный. Несмотря на массивное выделение возбудителя во внешнюю среду, благодаря крупнодисперсному характеру выделяемого аэрозоля передача микроба возможна только при тесном общении с больным. При этом заражение происходит на расстоянии не более 2 м от источника инфекции. Из-за нестойкости возбудителя во внешней среде передача через предметы обихода, как правило, не происходит.

4. Морфология и тинкториальные свойства

Представители рода Bordetella — мелкие кокковидные грамотрицательные палочки с закругленными концами (0,2-0,5 х0,5-2 мкм), биполярно окрашенные. Неподвижны. Спор не образуют. Имеют микрокапсулу и пили.

5. Питательные среды и культуральные свойства

B.pertussis требовательна к питательным средам. Росту бактерий препятствуют накапливающиеся в питательной среде жирные кисло­ты, поэтому в состав питательных сред входят адсорбенты — активи­рованный уголь, крахмал, альбумин, эритроциты и др.

1) Агар Борде-Жангу — картофеле-глицериновая среда + 20-30% дефибринированной крови. Колонии на среде Борде-Жангу вы­растают через 48-72 часа — мелкие (диаметр около 1 мм), выпук­лые, влажные, блестящие.

2) Казеинвво-угольный агар (КУА) содержит кислотный гидролизат казеина, крахмал, дрожжевой гидролизат, набор минераль­ных солей, активированный уголь. Колонии коклюшной палочки вырастают через 48-72 часа мелкие, выпуклые, типа «ртутной капли».

6. Антигенная структура

Коклюшные бактерии имеют О-антиген и семь К-антигенов, вы­являемых в реакции агглютинации. Эти антигены называются фактора­ми и обозначены цифрами 1-7. Фактор 1 имеется у всех штаммов B.pertussis, т.е. он видоспецифичен. По наличию и сочетанию антиге­нов 2, 3, 4 и 5 коклюшные бактерии подразделяются на серовары. Фак­тор 7 присутствует у всех Bordetella, что позволяет считать его родоспецифичным. B. parapertussis имеет видоспецифический фактор 14.

У B.pertussis обнаружены фазовые вариации, имеющие антиген­ные, культуральные и вирулентные отличия: от 1-ой фазы (S-вариант с выраженной вирулентностью, полноценными антигенными и харак­терными культуральнами свойствами) через промежуточные П и Ш фазы к IV фазе (авирулентный R-вариант, утерявший К-антигены). Переход от 1 к IV фазе наблюдается по ходу заболевания коклюшем.

7. Биохимические свойства

Облигатные аэробы. Бактерия оксидазоположительна, но не вырабатывает уреазу, нитразу, не содержит цитрата.

7. Факторы патогенности

А. Факторы адгезии и колонизации:

Пили, микроворсинки (филаментный гемагтлютинин — белок, свя­зывающий бактерии с ресничками эпителиоцитов слизистой).

Б. Антифагоцитарные факторы: капсула.

В. Токсические вещества:

1. Термолабильный экзотоксин (коклюшный токсин) — гистаминсенсибилизирующий, лимфоцитозстимулирующий, термостабильный (инактивируется при 80°С), действует на систему цАМФ.Токсин состоит из двух субъединиц — А и В. Субъединица В обеспечивает доставку субъединицы A к клеткам-мишеням, связываясь с их рецепторами. Кроме того, она сама по себе обладает биологической активностью, в частности стимулирует пролиферацию Т-лимфоцитов. Субъединица А проникает в цитоплазму и оказывает токсическое действие на клетку, вызывая выделение слизи из клеток слизистого эпителия в виде вязкой мокроты. Кро­ме того, он обладает свойствами адгезина, нарушает фагоцитар­ную активность нейтрофилов. Термолабильный токсин

2. Термостабильный эзотоксин — белок, связанный с цитоплазмой, инактивируется при 56°С; оказывает прямое действие на клетки реснитчатого эпителия;

3. Трахеальный цитотоксин, приводит к деструкции клеток реснитчатого эпителия;

4. Гемолизин — токсин, оказывающий местное действие на эпителий;

5. Аденилатциклаза — фермент, превращающий АТФ в цАМФ, дей­ствует как токсин. Усиливает действие коклюшного токсина, в том числе сенсибилизацию организма к токсическим субстан­циям B.pertussis, обладает антифагоцитарной активностью.

6. Эндотоксин (ЛПС наружной мембраны клеточной стенки) — вызывает лихорадку.

Патогенез

Входные ворота инфекции — клетки реснитчатого эпителия, выс­тилающие респираторный тракт. С помощью адгезинов — филаментного гемагглютинина, роль которого является основной, пилей и других факторов адгезии, B.pertussis прикрепляются к ресничкам эпителия тра­хеи и бронхов, колонизируют поверхность эпителиальных клеток, вы­зывая их повреждение. Эти процессы могут подавить специфические антитела класса A (sIgA).

При недостаточности этой первой линии защиты происходит интенсивное размножение коклюшных бактерий, при этом образуют­ся многочисленные токсические факторы, которые обладают согласо­ванным и целенаправленным действием как местным, так и системным.

В катаральный период коклюша повреждающее действие на эпи­телий оказывают трахеальный цитотоксин, термолабильный токсин и гемолизин.

Трахеальный цитотоксин — постоянно продуцируемый B.pertussis — не обладают прямой токсичностью. Но, взаимодействуя с макрофа­гами и клетками реснитчатого эпителия, цитотоксин стимулирует об­разование большого количества цитокинов, которые и оказывают деструктивное действие на эпителий.

В отличие от цитотоксина, термолабильный токсин обладает пря­мым токсическим действием на клетки эпителия. Таким образом, совместное действие этих токсинов вызывает воспалительную реак­цию эпителия респираторного тракта, характерную для катарального периода. Отмечается повышенная температура, насморк, небольшой кашель.

Следует отметить, что коклюшные бактерии вызывают поверх­ностное воспаление слизистой оболочки респираторного тракта, нередко распространяющееся по всей ее поверхности, но не проника­ют ни в подлежащие ткани, ни в кровяное русло.

При дальнейшем течении заболевания продолжается накопление токсических факторов и прежде всего коклюшного токсина. С дей­ствием коклюшного токсина связано наступление следующего перио­да заболевания — судорожного. Постепенно учащаются приступы судорожного (параксизмального) кашля и выделяется вязкая стекло­видная мокрота. Приступы судорожного кашля способствуют выведе­нию этой мокроты.

Продуцируемая B.pertussis аденилатциклаза усиливает действие коклюшного токсина, действуя в том же направлении. Она способствует повышению проницаемости капилляров и развитию отека, а также действует как гистаминсенсибилизирующий фактор.

На 5-ой неделе заболевания выделить возбудителя уже не удает­ся, тем не менее приступы судорожного кашля продолжаются еще дли­тельное время. Приступы могут вызвать различные неспецифические раздражители — громкий звук, яркий свет, осмотр больного врачом, медицинские процедуры и т.п. Предполагают, что эти приступы связа­ны с повышенной реактивностью поврежденной токсинами слизис­той оболочки дыхательных путей к различным раздражителям и снижением порога чувствительности к гистамину. В период разрешения кашель становится реже, теряет конвуль­сивный характер. Постепенно симптомы болезни исчезают.

Иммунитет

Иммунитет, вырабатываемый после перенесенного коклюша, стойкий, повторные заболевания чрезвычайно редки. Иммунитет имеет антимикробный и антитоксический характер, Основную роль играют специфические антитела, относящиеся к классам IgM, IgG и IgA. sIgA обеспечивают местный иммунитет на слизистых респираторного тракта.

Трансплацентарная передача антител от матери плоду не отмеча­ется, поэтому новорожденные дети чувствительны к B.pertussis с 1-го дня жизни.