ТЕМА: Микробиологическая диагностика воздушно-капельных инфекций: туберкулез, дифтерия

Цель занятия: знатьклассификацию и основные биологические свойства, факторы патогенности возбудителей, методы микробиологической диагностики, биопрепараты для этиотропной терапии и специфической профилактики указанных инфекций

уметь:микроскопироватьс масляной иммерсией микропрепараты, описывать морфологические и тинкториальные свойства бактерий; описывать культуральные свойства бактерий; определять токсигенность дифтерийных палочек

Задание на дом:

I. Вопросы для самоподготовки:

1) Характеристика биологических свойств и особенностей микробиологической диагностики возбудителей туберкулеза

2) Характеристика биологических свойств и особенностей микробиологической диагностики возбудителей дифтерии

II. Базовый текст

Возбудители туберкулеза

1. Классификация и таксономия

Туберкулез — хроническое гранулематозное инфекционное забо­левание, при котором чаще всего поражаются легкие. Но бывают и внелегочные формы заболевания — туберкулез кожи, костей и суста­вов, мочеполовой системы, кишечника, центральной нервной систе­мы и др.

Основным возбудителем туберкулеза является Mycobacterim tuberculosis, которыйотносится к домену Bacteria, типу Actinomycetеae, классу Actinobacteria, семейству Mycobacteriaceae, роду Mycobacterim (старое название BK — бацилла Коха).

По классификации Раньона различают четыре группы:

1. фотохромогенные микобактерии, приобретающие темно-оранжевую окраску при выращивании на свету. В полной темноте они не образуют пигмента. Основной представитель — М. kansassii;

2. фотохромогенные микобактерии, приобретающие ярко-оранжевую окраску независимо от выращивания на свету или в темноте. Основные представители — М. scrofu1асеum, М.gordonae, М. аguае и др.;

3. нефотохромогенные микобактерии, могут быть неокрашенными или иметь желтовато-оранжевые оттенки. Однако пигментация не зависит от экспозиции на свету. Основные представители — М. intractlulareе, М. battey;

4. быстрорастущие микобактерии образуют колонии в течение недели при 25^°С и 37^°С. Представители — М. рhlei, М. smegmatis, М. fortuitum.

2. Нозологичекие формы

К патогенным видам принадлежат:

M.tuberculosis вызывает туберкулез у человека в ≈ 92% случаев.

M.bovis вызывает туберкулез у крупного рогатого скота, свиней, овец, коз, верблюдов, буйволов, оленей, маралов, собак, кошек и других видов животных, а также человека в ≈ 5% случаев.

M.avium вызывает туберкулез в основном у птиц, кроликов, белых мышей, свиней; могут вызывать патологические изменения в органах у человека.

M.africanum вызывает туберкулез у людей в тропической Африке в ≈ 3% случаев.

M.paratuberculosis вызывает туберкулез у крупного рогатого скота, коз, верблюдов, овец, северных оленей.

К потенциально патогенным видам для людей принадлежат:

M.chelonei вызывают проходящие поражения у мышей, морских свинок, хомяков и кроликов, у человека — патологические изменения в синовиальной ткани коленного сустава и поражения в ягодичной части, подобно абсцессам.

M.xeponi выделены от жабы. Потенциально патогенны для человека.

M.ulcerans выделены из кожных поражений людей в Австралии, Мексике, Новой Гвинеи, Африке и Малайских островах.

Остальные более 16 видов микобактерий — не патогенны для человека.

3. Эпидемиология и пути передачи

Для современного периода характерно увеличение заболеваемо­сти, особенно среди заключенных и бомжей, повышение тяжести те­чения туберкулеза и смертности, распространение форм возбудителей, обладающих повышенной вирулентностью и множественной устой­чивостью к химиотерапевтическим препаратам.

Благодаря особому химическому строению оболочки, связанному с наличием большого количества липидов и липидсодержащих соединений, микобактерии туберку­леза обладают значительной устойчивостью к физическим и хи­мическим агентам. Во влажной мокроте микобактерии выдер­живают нагревание в течение 30 мин при 75 °С, при кипячении погибают через 5 мин. В выделенной мокроте микобактерии (МБТ) погибают при 100º С через 45 мин. В воде палочки выживают не менее 150 дней. МВТ выдерживают процессы гниения и мо­гут несколько месяцев сохраняться в погребенных трупах. Препараты хлора и йода эффективно действуют на микобактерии.

Основными путями заражения являются воздушно — капельный и воздушно — пылевой. Основным источником заражения является больной туберкулезом человек. Способ передачи заболевания обусловлен развитием гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), которая способствует распаду тканей, образованию полос­тей (каверн), из которых некротические массы, содержащие множе­ство туберкулезных микобактерий, попадают в бронхи и выделяются с мокротой при кашле во внешнюю среду, инфицируя окружающих людей. Прорыв туберкулезных гранулем в кровь может привести к распространению туберкулезного процесса на другие ткани и органы. При запущенных формах вторичного туберкулеза прогноз неблагоп­риятен.

4. Морфология и тинкториальные свойства

Микобактерии туберкулеза (МБТ) были открыты Р. Кохом в мокроте больного туберкулезом. Это тонкие, слегка изогнутые, гомогенные или зернистые палочки длинной от 0,8 до 3-5 мкм и шириной от 0,3 до 0,5 мкм. Величина палочек зависит от возраста микроба и условий его обитания. В казеозных массах палочки располага­ются неровными кучами по 2—3 и более. В различных условиях пребывания в организме палочки могут проявлять полиморфизм — образовать нитевид­ные, ветвящиеся формы с булавовидными образованиями на концах нитей.

При применении наиболее распространенного способа окраски (Циль-Нильсен) в палочках отмечаются более яркие крас­ные или фиолетовые гранулы. Исследование в электронном микроскопе позволило установить сложное строение их стенки из 3 слоев, а также наличие в цитоплазме гранул. В пре­паратах из культур, особенно на жидких средах, вирулентные МБТ располагаются в виде жгутов. В препаратах почти всегда имеются разной степени окраски округлые тельца (зерна). Это вегетативные формы, которые получаются в результате раз­множения микроба поперечным делением. Доказано существование некислотоустойчивых культур МБТ, которые названы L-формами. Эти формы способны расти на обычных средах и трансформироваться в бактерии.

5. Питательные среды и культуральные свойства

Микобактерии туберкулеза вне организма растут в чистых культурах на плотных и жидких средах с хорошим доступом воздуха. Используются глицериновые, белковые (яичные, сывороточные, картофельные) и синтетические. Они должны содержать факторы ро­ста, такие как витамины группы В, биотин, никотин, рибофлавин. На твердых средах рост туберкулезных микобактерий появляется на 14-20 сутки в виде светло-кремового морщинистого или суховато-че­шуйчатого налета, колонии с неровными краями (R-формы), по мере роста при­обретают бородавчатый вид, напоминающий «цветную капусту».

1. Среда Левенштейн-Йенсена содержит суспензию свежих ку­риных яиц, глицерин, аспарагин, крахмал, минеральные соли, раствор малахитовой зелени. Свертывают среду в пробирках в наклонном положении при 85°С 30-45 минут.

2. Среда Финна II содержит суспензию свежих ку­риных яиц, глицерин, натрия глутамат, минеральные соли, раствор малахитовой зелени. Свертывают среду по 4-5 мл в пробирках в наклонном положении при 85°С 30-45 минут.

3. Картофельно-глицериновая среда. Куски тщательно вымытого сырого картофеля вымачивают сутки в растворе бикарбоната натрия, а затем 2 суток в 6% растворе глицерина. Кладут приго­товленные куски картофеля в широкие пробирки или пробирки с перетяжкой, наливают немного раствора глицерина, стерили­зуют.

4. Среда Сотона — жидкая синтетическая среда содержит аспара­гин, глицерин, лимонную кислоту, гидрофосфат калия, сульфат магния, дигидрофосфат натрия, цитрат амми­ачного железа.

6. Антигенная структура

Микобактерии туберкулеза имеют сложный и мозаичный набор антигенов. Вирулентность туберкулезных микобактерии в значительной сте­пени обусловлена строением их трехслойных клеточных стенок, представ­ленных жирными кислотами, восками, сульфолипидами, а глав­ное — миколовыми кислотами и их производными. Миколовые кислоты обуславливают кислотоустойчивость мико­бактерии, участвуют в формировании комплекса пептидогликан-арабиногалактат-миколовая кислота. Этот комплекс образует прочный каркас клеточной стенки микобактерии. При нахождении микобакте­рии внутри клеток (они являются факультативными внутриклеточны­ми паразитами) они покрываются защитным восковым налетом. У микобактерии обнаружена полисахаридная микрокапсула.

МБТ выделяют токсины и эндо­токсин.

7. Биохимические свойства

Микобактерии туберкулеза имеют достаточно выраженную биохимическую активность. Ферменты эстераза и липаза расщепляют жиры; дегидраза — органические кислоты, в том числе аминокислоты; уреаза — мочевину, перигалоза — углеводы, каталаза — переоксид водорода; протеолитические ферменты (протеаза) — белок. Микобактерии ферментируют алкоголь, глицерин и многочисленные углеводы, лецитин, фосфатиды. У молодых культур микобактерий туберкулеза сильно выражены редуцирующие свойства, что, в частности, проявляется в их способности восстанавливать теллурит.

8. Факторы патогенности

А. Липидные фракции, входящие в состав клеточной стенки.

1. Корд-фактор — основной фактор патогенности. Это токсичес­кий гликолипид — эфир трегалозы и 2-х остатков миколовой кис­лоты (трегалоза-6,6-димиколат). Корд-фактор является фактором адгезии и колонизации, антифагоцитарным фактором, оказыва­ет токсическое действие на митохондрии после проникновения в клетки хозяина, нарушает окислительные процессы в тканях. Корд-фактор содержат только вирулентные бактерии. Он распо­ложен на поверхности клеточной стенки туберкулезных микобактерий, способствуя их гидрофобности, тесному склеиванию между собой, расположению в виде "жгутов". Выявляется при микрокультивировании по методу Прайса.

2. Воск Д — пептидогликолипид, содержащий миколовые кислоты, является антифагоцитарным фактором.

3. Сульфолипиды — располагаются в наружном слое клеточной стенки и в сочетании с димикоцерозат-фтиоцеролом (воск С) рассматриваются как фактор патогенности, так как способству­ет выживанию микобактерий внутри макрофагов, угнетают вы­деление лизосомальных ферментов.

4. Ацетонрастворимые липиды — усиливают иммунодепрессивные свойства микобактерий, при участии туберкулина способны мо­дифицировать мембраны клеток организма таким образом, что иммунные силы организма принимают эти клетки за инфициро­ванные и разрушают их (вместо того, чтобы направлять свое действие на инфицированные туберкулезными микобактериями клетки).

Б. Белковые факторы микобактерий туберкулеза.

5. Туберкулин — комплекс веществ, высвобождающихся при распаде туберкулезных микобактерий. Туберкулин не токсичен для здоровых людей. Он состоит из нескольких белковых фракций и содержит высокомолекулярные полисахариды. Это основной антиген, против которого направлен иммунный ответ инфицированного организма. Туберкулин обладает выраженными свойствами аллергена и токсичен только для инфицированных и больных туберкулезом людей и животных, у которых развилось состояние гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), как форма клеточного иммунного ответа. По своим антигенным свойствам туберкулин имеет сходство с антигенами главного комплекса гистосовместимости человека (HLA). Это сходство у разных людей выражено в разной степени. Чем такое сходство больше, тем более человек восприимчив к туберкулезной ин­фекции, тем менее выражен иммунный ответ, ГЗТ не развивает­ся. Таким образом, имеется генетическая предрасположенность к туберкулезной инфекции и ее хроническому те­чению.

9. Патогенез

В патогенезе заболевания различают два периода: первичный и вторичный. Туберкулезные микобактерий проникают аэрогенным путем в дыхательный тракт, вплоть до альвеол, где они фагоцитируются альвеолярными макрофа­гами, в которых долго остаются жизнеспособными. Незавершенный фагоцитоз связан с наличием у микобактерий антифагоцитарных фак­торов. Основной из них — корд-фактор, который повреждает мембра­ны митохондрий макрофагов, нарушает процесс слияния фагосом с лизосомами, а также оказывает токсическое действие на полиморфноядерные фагоциты. Таким образом, часто первая линия защиты — фагоцитоз — оказы­вается несостоятельной и развивается первичный туберкулез. Он ха­рактеризуется формированием специфического туберкулезного воспалительного очага или мелких очажков — туберкулезных грану­лем, имеющих сходное строение. Воспаление распространяется на отходящие лимфатические пути и региональный лимфатический узел, образуя первичный комплекс: гранулематозный воспалительный очаг + лимфангоит + лимфаденит. Воспалительный туберкулезный очаг (гранулема) содержит ха­рактерные элементы: в центре формируется творожистый некроз, ок­руженный эпителиоидными клетками (образуются из гистиоцитов и макрофагов) и клетками Пирогова-Лангерганса. (образующиеся из эпителиоидных клеток при их слиянии или при про­лиферации макрофагов). Туберкулезные микобактерии находятся в вос­палительном очаге как внеклеточно, так и внутри клеток. Очаг (грану­лема) содержит также лимфоидные клетки и нейтрофилы, располага­ющиеся ближе к периферии. При заживлении воспалительного очага творожистые массы каль­цинируются, вокруг очага образуется капсула из соединительной тка­ни, но внутри могут остаться жизнеспособные микобактерий, часто в виде L-форм. Такие зажившие очаги называются очагами Гона. Они формируются в легочной ткани и внутригрудных лимфоузлах. На этом первичный период может закончиться, но бывает и менее благоприят­ное течение. Воспалительные очаги в легких и лимфоузлах могут приобре­тать более распространенный характер, захватывать бронхи и плевру. Вследствие лимфо-и гематогенного заноса возбудителей в другие ткани и органы в них тоже возможно формирование постпервичных гранулематозных очагов. При достаточной напряженности иммунитета пер­вичный период часто заканчивается клиническим выздоровлением и заболевание больше не возобновляется. Этому способствует своев­ременно проведенная, полноценная химиотерапия.

Реже отмечается возврат болезни с развитием вторичного туберку­леза. Вторичный период легочного туберкулеза может возникать че­рез различные сроки после первичного туберкулеза и рассматривается как эндогенная инфекция. При этом происходит реактивация старых очагов на фоне сниженного иммунитета. Преимущественно заболева­ют люди зрелого и пожилого возраста. Для вторичного туберкулеза характерно хроническое волнообразное течение болезни с периодами обострения и улучшения состояния. При отсутствии или недостаточ­ности лечения развиваются множественные воспалительные очаги в легких, бронхах, внутригрудных лимфоузлах, в процесс может вовле­каться плевра.

10. Иммунитет

Человек обладает определенной естественной резистентностью к туберкулезной инфекции. Часто возбудители туберкулеза, попав в организм еще в детском возрасте, не вызывают видимых проявлений инфекции, за исключением виража туберкулиновой пробы. Тем не менее, возникает приобретенный иммунитет, развивается ГЗТ. Сход­ная картина наблюдается и после иммунизации живой вакциной BCG /БЦЖ.

Иммунитет при туберкулезе носит преимущественно клеточный характер, имеют значение и антитела. Фагоцитоз, ГЗТ и антитела осуществляют комплексное защитное действие. Каждый из этих ме­ханизмов в отдельности не может обеспечить состояние иммунитета. Фагоцитоз возбудителей, осуществляемый макрофагами, является не­завершенным. С развитием ГЗТ и появлением специфических анти­тел эффективность фагоцитоза повышается. Иммунные лимфоциты также участвуют в разрушении туберкулезных микобактерий: Т-лимфоциты при участии белков главной системы гистосовместимости класса I распознают клетки, инфицированные микобактериями туберкулеза, атакуют и разрушают их.

Иммунитет при туберкулезе считается нестерильным, т.е. для поддержания состояния иммунитета необходимо присутствие живых туберкулезных микобактерий (вирулентных или вакцинного штамма BCG).

11. Методы лабораторной диагностики

Применяют микроскопический, бактериологический (основной), биологический, серологический методы, кожные аллергические про­бы, ПЦР.

Исследуемые материалы многообразны и зависят от локализа­ции туберкулезных поражений, а именно: мокрота, бронхо-легочные аспираты, плевральная жидкость, ликвор, моча, костный мозг, гной, кровь и др. В данном пособии лабораторная диагностика разбирается на при­мере исследования мокроты.

А. Микроскопическое исследованиеявляется предварительным, так как не дает возможности надежно дифференцировать возбудите­лей туберкулеза от других микобактерий. Существует несколько вари­антов микроскопического исследования.

Прямая микроскопия исследуемого материала. Готовят маз­ки, растирая гнойный комочек мокроты между предметными стеклами, и окрашивают их по способу Циля-Нильсена. При микроскопии хорошо видны рубиново-красные кислотоустой­чивые микобактерии на общем голубом фоне мокроты, некис­лотоустойчивые бактерии и форменные элементы имеют синий цвет. Для положительного заключения необходимо просмотреть 100 полей зрения, указав количество обнаруженных в них кис­лотоустойчивых бактерий. Прямая микроскопия — это сравни­тельно малочувствительный метод, позволяющий обнаружить микобактерии при их содержании в мокроте не менее 100000 клеток/мл.

Непрямая микроскопия предварительно обогащенного материала. Методы обогащения основаны на прин­ципе извлечения микобактерии из мокроты и их концентрации в малом объеме.

а) Гомогенизация.В банку с мокротой, собранной в течение суток, добавляют 1 % раствор NaOH и энергично встряхивают в шюттель-аппарате. Гомогенизированную мокроту центрифугируют при 3000 об/мин, осадок нейтрализуют, добавив 1 -2 капли 10% раствора НСl. Мазки из осадка окрашивают по Цилю-Нильсену.

б) Флотация.Гомогенизированную мокроту помещают в колбу, добавляют 1-2 мл ксилола (или бензола) и встряхивают в течение 10 минут, доливают дистиллированную воду до горлышка колбы и дают отстояться. В горлышке колбы образуется сливкообразный слой, состоящий из всплывших мельчайших капелек ксилола с сорбированными на них микобактериями. Из этого слоя готовят мазки на предметном стекле путем повторного наслаивания и окрашивают их по Цилю-Нильсену.

Методы обогащения повышают вероятность обнаружения мико­бактерии на 10%.

Люминесцентная микроскопия. Основана на способности липидов микобактерий поглощать люминесцентные красители и светиться в люминесцентном микроскопе. Мазки, приготовленные из осадка гомогенизированной мокроты (или флотационные мазки), окрашивают водным раствором флюорес­центных красителей — ауромин + родамин С — и микроскопируют в люминесцентном микроскопе с объективом х40, х90, х100. Туберкулезные ми­кобактерии светятся золотисто-желтым светом на темно-зеленом фоне, нетуберкулезные микобактерии дают зеленое свечение. Люминесцентная микроскопия повышает вероятность выявления микобактерии на 17%, т.е. наиболее чувствительна из микроскопичес­ких методов.

Б. Микрокультивирование — метод Прайса.Ускоренный ме­тод, сочетающий микроскопическое исследование с элементами бак­териологического метода (предварительное микрокультивирование). Дает возможность выявить туберкулезные микобактерии при их ма­лом содержании, а также наличие у них корд-фактора и тем самым доказать их вирулентность. Этапы микрокультивирования микобактерий туберкулеза по методу Прайса:

1. приготовление мазка из осадка (центрифугата) гомогенизированной мокроты или флотационного слоя;

2. обработка мазков серной кислотой для уничтожения посторонней микрофлоры;

3. промывают мазки сте­рильной дистиллированной водой;

4. инкубация нескольких стекол с мазками в пробирке с жидкой синтетической питательной средой (или разведенной цитратной кровью);

5. ежедневное окрашивание по одному мазку способом Циля-Нильсена.

При проведении иммерсионной микроскопии вирулентные туберкулезные микобактерии, содержащие корд-фактор, образуют микроколонии из тесно склеенных между собой рубиново-красных палочек в виде изогнутых «жгутов» или «кос». Микроколонии невирулентных туберкулезных микобактерии представ­ляют собой беспорядочные рыхлые скопления бактериальных клеток.

В. Бактериологическое исследование является основным ме­тодом, позволяющим получить чистую культуру возбудителя туберку­леза, идентифицировать ее и определить лекарственную устойчивость (степень ее чувствительности) к химиотерапевтическим противотубер­кулезным препаратам. Бактериологическим методом удается выделять микобактерий при их концентрации от 20-100 живых бактерий в 1 мл клинического материала. Основной недостаток — длительность иссле­дования.

Исследуемый материал подвергают предварительной обработке (обогащению) для концентрации микобактерий и уничтожения посторонней микро­флоры. Мокроту обрабатывают щелочью (2% раствор NaCl) или кислотой (10% раствор H₂SO₄) подвергая встряхиванию, затем центрифугируют. Полученный осадок нейтрализуют и засевают в несколько про­бирок с яичной средой Левенштейна-Йенсена. Используют и другие среды — яичную среду Финна II, картофельно-глицериновую, жидкую среду Сотона. Засеянные пробирки плотно укупоривают во избежание высыхания и инкубируют при 37°С до 2-3 месяцев, еженедельно просматривая. Видимый рост появляется, на­чиная с 10-12-14 дней и позже.

Ниациновая проба — ценный тест, с помощью которого M.tuberculosis дифференцируют от M.bovis и нетуберкулезных мико­бактерий. Только M.tuberculosis способны синтезировать никотиновую кислоту (ниацин) при культивировании на яичных средах. Для выяв­ления ниацина к выросшей культуре добавляют растворы 10% циани­стого бромида и 4% анилина. В положительном случае появляется ярко-желтое окрашивание.

Кроме того, у чистой культуры изучают скорость роста, образо­вание пигмента (на свету или в темноте), способность к росту при 20-25°С и к росту на простых питательных средах, наличие каталазы и пероксидазной активности и некоторые другие биологические про­бы. Эти пробы позволяют дифференцировать возбудителей ту­беркулеза.

У выделенных культур туберкулезных микобактерий в обязатель­ном порядке определяют степень лекарственной устойчивости к про­тивотуберкулезным химиопрепаратам. Для этой цели культуру засевают в пробирки со средой Левенштейна-Йенсена, в которые перед сверты­ванием были внесены различные концентрации химиопрепаратов. Окончательную оценку проводят после 3-х недель инкубации. Учиты­вают отсутствие роста или степень его интенсивности в присутствии различных концентраций химиопрепаратов. Полученные результаты используют для назначения рациональной химиотерапии.

Г. Биологический метод в настоящее время применяют редко в диагностике туберкулеза легких, чаще всего при диагностике тубер­кулеза почек. Материалом от больного заражают лабораторных жи­вотных (морских свинок, чувствительных к M.tuberculosis, кроликов, восприимчивых к M.bovis), Наблюдают за животными в течение 1-2 месяцев до их гибели. С 5-10 дня после заражения можно исследовать пунктат лимфатических узлов.

Д. Серологический метод проводят для выявления антител в сыворотках больных туберкулезом или микобактериозом, а также для обнаружения антигенов микобактерий в исследуемом материале. С этой целью используют различные серологические реакции, такие как РСК, РИГА, РИА, ИФА.

Е. Кожно-аллергическая проба (туберкулинодиагностика) вы­являет ГЗТ, развивающуюся у вакцинированных вакциной БЦЖ, ин­фицированных и больных туберкулезом. Осуществляется с помощью препаратов туберкулина, который вводят накожно или внутрикожно.

Проба Манту — внутрикожная проба — применяется как основной метод туберкулинодиагностики при массовых ежегодных об­следованиях. Ее назначение:

- отбор контингентов лиц для ревакцинации БЦЖ;

- перед первичной вакцинацией детей в возрасте 2 месяцев и более;

- для диагностики туберкулеза, в том числе для раннего выявле­ния начальных и локальных форм туберкулеза у детей и подростков;

- для определения инфицирования микобактериями туберкулеза.

При постановке пробы Манту туберкулин вводят на внутреннюю поверхность предплечья строго внутрикожно. Учитывают реакцию через 72 часа. Гиперемия учитывается только в случае отсутствия ин­фильтрата.

Проба Манту считается отрицательной при наличии только уколочной реакции (0-1 мм), сомнительной при гиперемии без папулы или наличии папулы диаметром 2-4 мм; положительной — при папуле диаметром 5 мм и более.

12. Лечение и профилактика

Специфическая профилактика осуществляется вакциной БЦЖ (BCG — Bacillus Calmette-Guérin). Вакцина БЦЖ и БЦЖ-М (со сни­женной антигенной нагрузкой) содержит живые, ослабленные мико­бактерии вакцинного штамма БЦЖ-1, лиофильно высушенные в 1,5% растворе натрия глютамината. Вакцина была получена А.Кальметтом и М.Гереном из штамма M.bovis длительным пассированием (230 пе­ресевов в течение 13 лет) на картофельно-глицериновой среде с до­бавлением желчи (метод аттенуации). Штамм сохранил остаточную вирулентность.

Вакцинацию проводят всем новорожденным на 5-6 день в роддо­ме внутрикожно. Ревакцинацию проводят в 7 лет и далее с интервалом в 5 лет до 30 летнего возраста при отрицательных туберкулиновых пробах.

Лечение туберкулеза проводится химиопрепаратами (антибиоти­ками и синтетическими препаратами). Их подразделяют на препараты первого ряда (изониазид, этамбутол, стрептомицин, пиразинамид, рифампицин и др.) и альтернативные (канамицин, циклосерин, ПАСК, этионамид и др.)

Возбудители дифтерии

1. Классификация и таксономия

Дифтерия — острое инфекционное заболевание, характеризующее­ся фибринозным воспалением на месте входных ворот (чаще всего глот­ки) и тяжелой интоксикацией организма с преимущественным поражением сердца, почек и нервной системы.

Возбудителем дифтерии является Corynebacterium diphtheriae, который относится к домену Bacteria, типу Actinomycetеae, порядку Actinomycetales, классу Actinobacteria, семейству Corynebacteriaceae, отделу Firmicutes, роду Corynebacterium (старое название BL — бацилла Леффлера).

2. Нозологические формы

Дифтерия как заболевание выделена в самостоятельную нозологическую форму.

Клиническая классификация дифтерии подразделяет заболевание на следующие формы с вариантами течения заболевания:

1. Дифтерия ротоглотки: дифтерия ротоглотки локализованная с катаральным, островчатым и плёнчатым вариантами; дифтерия ротоглотки распространённая; дифтерия ротоглотки субтоксическая; дифтерия ротоглотки токсическая (I, II и III степеней); дифтерия ротоглотки гипертоксическая.

2. Дифтерийный круп: дифтерия гортани (дифтерийный круп локализованный); дифтерия гортани и трахеи (круп распространённый); дифтерия гортани, трахеи и бронхов (нисходящий круп).

3. Дифтерия носа.

4. Дифтерия половых органов.

5. Дифтерия глаз.

6. Дифтерия кожи.

7. Комбинированные формы с одновременным поражением нескольких органов.

3. Эпидемиология и пути передачи

Источником инфекции при дифтерии является человек (больной, реконвалесцент, бактерионоситель); наибольшую эпидемическую опасность представляют больные лица. Реконвалесценты выделяют дифтерийную палочку в течение 15-20 суток. Основной путь передачи дифтерийной палочки — воздушно-капельный; также возможно заражение через предметы, используемые больным, и инфицированные пищевые продукты (обычно молоко).

4. Морфология и тинкториальные свойства

Возбудитель дифтерии Corynebacterium diphtheriae — это палочки, с колбовидными вздутиями на концах, что придает микробу сходство с була­вой, длинной 1-6 мкм, толщиной 0,3-0,8 мкм. Отличительные признаки: наличие вклю­чений волютина на концах клеток (тельца Бабеша-Эрнета) и расположение бактерий в микропре­парате под углом — в виде латинских букв V, Y, L, «растопыренных пальцев». Живые микробы неподвижны, жгутиков не имеют, спор не образуют, характеризуются наличием пили и микрокапсулы. Грамположительны.

У Corynebacterium diphtheriae выделяют три биовара — gravis, mitis и intermedius. Бактерии биовара дифтерииgravis — короткие неправильной формы, с небольшим количеством метахроматических гранул. Биовар дифтерииmitis образуют длинные изогнутые полиморфные палочки, содержащие много волютиновых зёрен (тельца Бабеша-Эрнста). Бактерии биовара дифтерииinmtermedius наиболее крупные, с бочковидными очертаниями; для них характерны поперечные перегородки, разделяющие клетку на несколько сегментов. В настоящее время биовар дифтерии intermedius относят в группу gravis.

5. Питательные среды и культуральные свойства

Бактерии хорошо развиваются при свободном доступе кислорода, при температуре от 15 до 40ºС. Могут расти на обычных питательных средах, но лучше и с характерной морфологией развиваются на средах, содержащих кровь или сыворотку любого вида животного.

Среды должны содержать в качестве источников азота аминокис­лоты: β-аланин, цистин, метионин, валин и др. Дифтерийная палочка способна восстанавливать металлический теллур из его солей. Теллурит калия является ингибитором микрофлоры, встречающейся в зеве.

1. Кровяной теллуритовый агар (КТА) состоит из питательного агара, 2% раствора теллурита калия и дефибринированной или гемолизированной лоша­диной или бычьей крови (10%). Колонии C.diphtheriae появля­ются через 18-24 часа черного цвета или серого с черным центром.

2. Среда Клауберга II состоит из питательного агара, 2% раствора теллурита калия, глицерина, гемолизированной крови. Через 24 часа вырастают матово-черные, неслившиеся плоские колонии, Че­рез 48-72 часа возможна их дифференциация на биотипы. Тип gravis образует серовато-черные колонии с несколько изрезан­ными краями, колонии типа mitis растут в виде мелких блестя­щих серовато-черных колоний с ровными краями.

3. Свернутая сыворотка — среда Ру — представляет собой чистую сыворотку крови любого происхождения. Ее разливают по 3 мл в пробирки и в наклонном положении пробирки нагревают в течение 1 часа при 80°С для свертывания. Колонии на среде Ру вырастают через 12-18 часов мелкие, диаметром 0,5-1,0 мм, круг­лые, суховатые, кремово-желтого цвета, не сливающиеся даже при сплошном посева.

6. Антигенная структура

Дифтерийные бактерии имеют довольно сложную антигенную структуру и серологически неоднородны. Выделяют О-и К-антигены. Полисахаридные компоненты О-антигенов клеточной стенки обладают межродовыми свойствами, обусловливая неспецифические перекрестные реакции с микобактериями, актиномицетами (нокардиями). Поверхностные К-антигены — капсульные белки, обладают видовой специфичностью и иммуногенностью.

7. Биохимические свойства

Дифтерийная палочка вырабатывает кислоту без газообразова­ния в средах с глюкозой, мальтозой и галактозой, но не с лак­тозой, сахарозой и маннитом. Сбраживание крахмала и глико­гена считают характерной особенностью типа gravis. Многие штаммы дают гемолиз на кровяном агаре и лизируют эритро­циты, добавленные к культуре.

Дифтерию вызывают только токсичные штаммы, об­ладающие способностью продуцировать экзотоксины. Степень токсичности дифтерийных микробовможет быть раз­личной. Единицей измерения силы токсина служит минимальная смертельная доза (DLM) — наименьшее количество токсина, убиваю­щее морскую свинку массой 250 г в течение 3-4 суток. Кроме экзотоксина дифтерийная палочка продуцирует дермонекротоксин, гемолизин, нейраминидазу и гиалуронидазу.

Синтез дифтерийного токсина микробными клетками детерминирован специальным геном tox, локализующимся в ДНК лизогенного фага. Токсин продуцируют крупных размеров особи возбудителя, в которых отмечается спонтанная продукция фага. Генетические структуры, управляющие синтезом дифтерийного токсина, функционируют независимо от всех органоидов, обеспечивающих жизнедеятельность микробов. В связи с этим коринебактерии могут терять ген tox, и, собственно, патогенные свойства.

8. Факторы патогенности

1.Факторы адгезии и колонизации, которые до настоящего вре­мени не идентифицированы. Возможно, эти функции выполня­ют: пили, микрокапсула, компоненты клеточной стенки, с помощью которых C.diphtheriae прикрепляются к эпителиоцитам слизистой и колонизируют их.

2.Инвазивные свойства связаны с гиалуронидазой, нейраминидазой и гемолизином, которые участвуют в развитии некроти­ческих процессов слизистой оболочки и разжижении основного вещества соединительной ткани.

3.Дифтерийный токсин (гистотоксин) — основной фактор па­тогенности. Подобно многим бактериальным токсинам, он со­стоит из фрагментов А и В, выполняющих, соответственно ферментативную и рецепторную функции. Фрагмент В связы­вается с белковыми рецепторами на клетке-мишени, способствуя проникновению в нее фрагмента А, который обладает НАД-гликогидролазной и АДФ-рибозилтрансферазной активностью. Действуя внутриклеточно, фрагмент А расщепляет НАД и инактивирует фактор элонгации-2, который отвечает за построение пептидных цепей на рибосомах в эукариотических клетках. В результате прекращается биосинтез бел­ка и наступает гибель клеток.

4. Корд-фактор (димиколат трегалозы) нарушает процессы ды­хания в митохондриях эукариотических клеток, прежде всего в фагоцитах, обладает антифагоцитарной активностью.

9. Патогенез

Входные ворота инфекции — слизистые оболочки носоглотки, гор­тани, в редких случаях слизистая оболочка глаза, поврежденная кожа. В подавляющем большинстве случаев входными воротами является сли­зистая оболочка глотки и развивается дифтерия зева. При дифтерии зева процесс может распространиться на нижележащие дыхательные пути или пойти вверх, поражая слизистые оболочки носа и среднего уха. В зависимости от тяжести заболевания, различают три формы этой ин­фекции: локализованную, распространенную и токсическую.

C.diphtheriae прикрепляются к поверхности эпителия миндалин и окружающих тканей мягкого неба (адгезия) и, колонизируя эту область, продуцируют дифтерийный гистотоксин и другие факторы патогеннос­ти, что приводит к развитию фибринозно-некротического фарингита и общей интоксикации организма больного.

Дифтерийный токсин вызывает гибель клеток эпителия, подавля­ет фагоцитоз, повреждает эндотелий сосудов субэпителиальной ткани. Происходит обильная экссудация плазмы на поверхность некротизированного эпителия, где содержащийся в плазме фибриноген превращает­ся в фибрин. Образуется толстая серовато-белая пленка (псевдомембрана), тесно спаянная с подлежащей тканью. Такой тип воспаления называют дифтеритическим. Пленка состоит из сгустков фибрина, некротизированной ткани, содержит множества дифтерийных бактерий, которые здесь защищены от воздействий факторов иммуни­тета и имеют прекрасные условия для размножения и выработки токси­на.

Развитию процессов некротизации эпителия способствуют фер­менты, вырабатываемые C.diphtheriae.

10. Иммунитет

Иммунитет после перенесенной дифтерии отличается значитель­ной стойкостью, носит преимущественно антитоксический характер. В последнее время уделяется внимание и антибактериальному имму­нитету, его роли в предотвращении развития инфекции на начальном этапе и в противодействии формированию бактерионосительства.

11. Методы л

Наши рекомендации