Методы изучения морфологии микроорганизмов

6.1. Методы микроскопии

Для изучения морфологии микроорганизмов необходим микроскоп. В микробиологии используют два вида микроскопии – электронную и световую.

А. Электронная микроскопия используется специализированными лабораториями.

1. Для ее осуществления необходим электронный микроскоп (Рис. 6-1).

Рис. 6-1. Электронный микроскоп (лаборатория Нижегородского университета, Россия)

2. Принципегодействия заключается в том, что вместо световой волны используется пучок электронов, что позволяет увеличить чувствительность метода на несколько порядков.

3. Электронная микроскопия используется для обнаружения и изучения вирусов, а также для изучения ультраструктуры бактериальной клетки.

Б. Световая микроскопия может использоваться и обычными лабораториями.

1. Обычная световая микроскопия используется в микробиологической практике сравнительно редко. В обиходе микробиологов этот метод часто называется «сухим», в противоположность иммерсионному методу микроскопии.

а. Для этого вида микроскопии используется обычный биологический микроскоп(Рис. 6-2).

б. Принцип действия этого микроскопа рассматривается в курсе физики.

в. «Сухой» объектив может использоваться, например, для микроскопирования препарата «придавленная капля» при определении подвижности бактерий.

2. При иммерсионной микроскопии используется специальное иммерсионное масло.

а. В качестве иммерсионного микроскопа служит обычный биологический микроскоп, но оснащенный специальным объективом (маркированным черной полосой).

б. Принцип метода заключается в том, что иммерсионное масло, обладая коэффициентом преломления чрезвычайно близким к коэффициенту преломления стекла, делает потерю световых лучей на границе сред предметное стекло/масло и масло/стекло объектива минимальной, что улучшает качество микроскопической картины и увеличивает разрешающую способность микроскопа.

в. Именно иммерсионная микроскопия используется в бактериологии наиболее часто.

3. Более редко в бактериологии используется темнопольная микроскопия.

а. С этой целью обычный биологический микроскоп оснащается специальным темнопольным конденсором.

б. Принцип его действия заключается в том, что все прямые лучи минуют объектив, куда попадают лишь те из них, которые преломились на объекте микроскопирования. Поэтому микроорганизмы видны как светящиеся объекты на темном фоне.

в. Темнопольная микроскопия наиболее часто используется для обнаружения спирохет, так как позволяет визуализировать очень тонкие объекты.

4. В ряде случаев в бактериологических лабораториях используется фазово-контрастная микроскопия.

а. Для этого обычный биологический микроскоп оснащается специальной приставкой с особым набором линз (Рис. 6-3).

б. Принцип её действия заключается в том, что смещение фазы световой волны, происходящее при её прохождении через прозрачные для нашего глаза объекты и не воспринимаемое человеческим глазом (собственно именно поэтому такие объекты и выглядят прозрачными), преобразовывается в изменение амплитуды световой волны. А изменение этого параметра воспринимается нашим глазом – объект становится видимым.

в. Фазово-контрастная микроскопия используется, как правило, для обнаружения очень тонких (например, спирохеты, жгутики бактериальной клетки) или высоко прозрачных (например, микоплазмы) объектов.

5. И бактериологические и иммунологические и вирусологические лаборатории не могут считаться современными без возможности использования люминесцентной микроскопии.

а. Для этой цели служит особый люминесцентный микроскоп(Рис.6-4).

Рис. 6-2. Биологический микроскоп (БИОЛАМ Р-11)

Рис. 6-3. Микроскоп с фазово-контрастным набором

Рис. 6-4. Люминесцентный микроскоп (Олимпус ВХ 41)

б. Принцип её действия заключается в том, что используемые при обработке мазка для этого вида микроскопии особые, люминесцентные, красители вызывают свечение микроскопируемого объекта под воздействием коротковолнового (чаще всего – синего) света, которым он освещается (явление наведённой люминесценции).

в. Люминесцентная микроскопия широко используется в современной микробиологии.

1. Для выявления в мазке некоторых видов бактерий используются специальные флюоресцентные красители, обуславливающие специфическое свечение изучаемых микроорганизмов.

а. Для выявления возбудителя сибирской язвы используется родамин.

б. Красное свечение зёрнам волютина, наличие которых позволяет идентифицировать коринебактерии, обуславливает корефосфин.

в. Аурамин используется для выявления микобактерий туберкулёза, которые, при обработке мазка этим флюорохромом и микрокопировании его в люминесцентном микроскопе, выглядят как жёлтые палочки на зелёном фоне.

2. Люминесцентная микроскопия используется также для оценки реакции иммунофлюоресценции. Если антитела диагностической сыворотки адсорбируются на поверхности клетки, содержащей выявляемый антиген, то в люминесцентном микроскопе такая клетка будет окружена жёлто-зелёным ободком, так как антитела флюоресцирующей сыворотки метятся специальным флюорохромом – флюоресцеинизотиоционатом натрия (ФИТЦ).

6.2. Методы окраски мазков

В основном для окраски микроорганизмов используются анилиновые красители. В зависимости от их количества и, соответственно, цели исследования все методы окраски подразделяются на две группы.

А. При простых методах окраски используется лишь одна краска.

1. С этой целью в бактериологии используются, как правило, или водный фуксинили метиленовая синька.

2. Простые методы окраски используются для ориентировочной, предварительной, микроскопии – определения наличия в патологическом материале бактерий, определение их формы и расположения в мазке.

Б. При сложных методах окраски используются ряд красок в определенной последовательности. Такие методы используются для выявления в патологическом материале конкретных микроорганизмов, а также определения особенностей их ультраструктуры.

1. Окраска по Граму используется для определения типа строения клеточной стенки. Это основной метод в бактериологии. В зависимости от окраски по Грамму все бактерии подразделяются на грамположительные и грамотрицательные.

2. Окраска по Цилю-Нильсену используется для выявления кислотоустойчивых бактерий (а именно – микобактерий), а также для обнаружения спор.

3. Окраска по Нейссеру используется для выявления цитоплазматических включений волютина и идентификации по их наличию коринебактерий (в частности – возбудителей дифтерии).

4. Окраска по Бури-Гинсу используется для выявления макрокапсул.

5. Окраска по Морозову используется для выявления жгутиков. Этот метод окраски используется также для выявления трепонем. Кроме того, окраску по Морозову используют в вирусологии – для выявления в оспенных пузырьках вирусов натуральной и ветряной оспы.

6. Окраска по Здрадовскому используется для выявления риккетсий и хламидий.

7. Окраска по Романовскому-Гимзе также, наряду с окраской по Здрадовскому, используется для выявления риккетсий и хламидий; кроме того, этот метод окраски используется для выявления спирохет (с их идентификацией до рода в зависимости от цвета окрашивания), а также для выявления простейших.

6.3. Окраска по Граму

Окраска по Граму – основной метод окраски в бактериологии. С окраски по Граму начинается описание морфологических свойств. Такое значение этого метода обуславливается тем, что окраска бактериальной клетки по Граму зависит от типа строения её клеточной стенки и, соответственно, принадлежности к отделу Firmicutes или Gracilicutes – первого этапа идентификации любого вида в бактериологии. Окраска по Граму осуществляется в четыре этапа (Рис. 6-5 – 6-8).

А. На первом этапе фиксированный мазок окрашивается генциановым фиолетовым.

1. Окрашивание продолжается 1 – 2 минуты.

2. И грамположительные и грамотрицательные бактерии окрашиваются этой краской в синий цвет.

Б. На втором этапе мазок обрабатывается раствором Люголя, который формирует с генцианвиолетом красящий комплекс, локализующийся на цитоплазматической мембране.

1. Обработка раствором Люголя продолжается 1 – 2 минуты.

2. И грамположительные и грамотрицательные бактерии на этом этапе остаются синими.

В. На третьем этапе мазок обесцвечивается спиртом.

1. Обесцвечивание спиртом продолжается примерно 20 секунд с последующим обильным промыванием водой.

2. Грамположительные бактерии за это время не успевают обесцветиться и остаются синими, а грамотрицательные, вследствие более тонкого слоя пептидогликана, препятствующего вымыванию спиртом красящего комплекса, обесцветиться успеют и, следовательно, станут бесцветными.

Г. На четвертом этапе мазок окрашивается водным фуксином или другой красной краской – сафранином.

1. Докраска красной краской продолжается 1 – 2 минуты. Причем, этот этап лучше продлить подольше, так как после обесцвечивания бактериальная клеточная стенка воспринимает краску хуже, чем обычно.

2. Грамположительные бактерии остаются синими, так как они уже окрашены более темной краской а грамотрицательные, которые на предыдущем этапе обесцветились, на этом этапе окрашиваются в красный цвет(Рис. 6-9).

Рис. 6-5. Окраска по Грамму – первый этап: окраска генциановым фиолетовым	Рис. 6-6. Окраска по Граму – второй этап: обработка раствором Люголя	Рис. 6-7. Окраска по Грамму – третий этап: обесцвечивание спиртом
Рис. 6-8. Окраска по Грамму – четвертый этап: окраска водным фуксином или сафранином	Рис. 6-9. Грамположительные и грамотрицательные бактерии в мазке, окрашенном по Граму

Д. Грамположительные бактерии составляют меньшую часть тех бактерий, которые изучает медицинская микробиология. Ниже приводятся основные (этот перечень будет позже добавлен неспорообразующими анаэробами).

1. Грамположительными являются большинство кокков (кроме нейссерий): стафилококки, стрептококки и пневмококки, энтерококки.

2. Среди палочек грамположительными являются листерии, бактерии актиномицетного ряда (актиномицеты, микобактерии, коринебактерии), спорообразующие палочки (бациллы и клостридии).

Е. Большинство бактерий, имеющих медицинское значение, грамотрицательные. Лишь по отношению к микоплазмам не корректно говорить об их грамотрицательности (хотя по Граму они окрашивались бы в розовый цвет – если бы их так окрашивали, так как на практике этот метод в изучении микоплазм не применяется). Дело в том, что грамоложительные и грамотрицательные бактерии отличаются друг от друга типом клеточной стенки (прежде всего – количеством содержащегося в ней пептидогликана), а у микоплазм клеточной стенки с содержанием пептидогликана нет.

1. Из кокков грамотрицательные – нейссерии.

2. Грамотрицательными являются большинство палочек (собственно все, за исключением перечисленных выше грамположительных).

3. Клеточную стенку грамотрицательного типа имеют также спирохеты.

6.4. Окраска по Цилю-Нильсену

Окраска по Цилю-Нильсену используется в бактериологии для выявления эндоспор и для индикации микобактерий. В осуществлении этого метода также можно выделить четыре этапа.

А. На первом этапе на фиксированный мазок помещается фильтровальная бумага, на которую наливается фуксин Циля. Фуксин Циля отличается от водного фуксина («фуксина Пфейффера») более высокой концентрацией и наличием карболовой кислоты, вследствие чего для его обозначения используется также термин «карболовый фуксин». После чего предметное стекло с мазком нагревается над пламенем горелки.

1. Окрашивание продолжается примерно 5 минут, но, как правило, продолжительность этого этапа определяется «отхождением трех паров»: стекло держат над пламенем до появления парения, после чего отводят в сторону и ждут прекращения парения – и так три раза.

2. Мазок на этом этапе окрашивается в красный цвет. Обычными методами споры и микобактерии окрасить нельзя – вследствие особенностей своего химического состава они не воспринимают анилиновые красители при обычном режиме окраски. Чтобы их окрасить, необходимо использование сочетанного действие трех факторов: повышенной концентрации краски, обработка кислотой и повышенная температура (так называемое «термокислотное протравливание»).

Б. На втором этапе мазок обязательно нужно выдержать некоторое время на воздухе для охлаждения, иначе стекло на следующем этапе может лопнуть.

В. На третьем этапе мазок обесцвечивается кислотой. Обычно используется серная кислота – 1% для окраски спор и 5% для окраски микобактерий.

1. Обесцвечивание продолжается от 2 до 5 секунд с последующим обильным промыванием водой.

2. Споры и клетки микобактерий не обесцвечиваются (свойство кислотоустойчивости) и остаются красными. Все остальное – обесцвечивается.

Г. На четвертом этапе мазок окрашивается метиленовой синькой.

1. Окраска продолжается 3 – 5 минут. При этом лучше этот этап продлить подольше по той же причине, что и последний этап окраски по Граму.

2. Споры и микобактерии эту краску не воспримут и останутся красными, а вегетативная часть клетки и все бактерии, за исключением микобактерий окрасятся в синий цвет (Рис. 6-10 – 6.11).

Рис. 6-10. Бациллы, содержащие споры, окрашенные по Цилю-Нильсену

Рис. 6-11. Микобактерии в мокроте больного туберкулёзом, окрашенные по Цилю-Нильсену