Обнаружение специфических антигенов с помощью ИФА и РИМ

Первый этап – адсорбция специфических антител твердой фазой, в качестве которой обычно используют поверхности пластиковых панелей. Когда антитела связываются со стенками лунок, у них сохраняются свободными активные центры, поэтому они способны специфически реагировать с соответствующим антигеном.

Второй этап – связывание антигена из исследуемого материала за счет реакции антитело + антиген. После этого луночки промывают, дли удаления из системы других, неспецифическисвязанных с антителами компонентов.

Третий этап — обработка специфическими антителами против данного антигена, меченным либо ферментом, либо изотопом. Такие меченые антитела присоединяются к антигенам, а их избыток удаляется из системы промыванием. Таким образом, в случае присутствия в исследуемом материале искомого антигена на поверхности твердой фазы формируется комплекс антитело + антиген + меченое антитело. Результаты реакции учитывают в зависимости от характера метки. Для иммуноферментного метода антитела метят ферментом, чаще всего пероксидазой или щелочной фосфатазой. Добавление в опытную луночку раствора субстрата приводит к тому, что он подвергается действию пероксидазы, фиксированной на антителах, образующиеся продукты реакции имеют желтую окраску, интенсивность которой может быть определена путем фотометрии.

Радиоиммунный метод(РИМ) предусматривает использование антител, меченных изотопом, поэтому результаты реакции оценивают путем определения радиоактивности исследуемых образцов. При положительной реакции уровень радиоактивности опытных образцов более чем в 2 раза превышает уровень радиоактивности контрольных, заведомо отрицательных образцов.

Обнаружение специфических антител с помощью ИФА и РИМ

Для обнаружения антител реакции также ставят в три этапа.

Первый этап— адсорбция специфических антигенов на стенках луночек. Обычно планшеты в коммерческих тест-системах уже имеют сенсибилизированные луночки, т. е. на их стенках антигены уже адсорбированы.

Второй эта — добавление в луночки образцов исследуемой сыворотки для обнаружения в ней специфических антител к данному антигену. Если они имеются, то вступают во взаимодействие с антигеном и образуют комплекс антиген + антитело.

Третий этап— после отмывания луночек в них добавляют специфические антиглобулиновые антитела (т. е. антитела против человеческих иммуноглобулинов), но меченные ферментом (ИФА) либо изотопом (РИМ). Результаты реакции оценивают, как указано выше. В качестве контроля используют образцы, заведомо положительные и заведомо отрицательные.

Предложены различные варианты иммуноферментного метода. Большое значение имеет вариант ИФМ, позволяющий осуществлять «захват» только антител, относящихся к IgM. Этот метод позволяет более точно производить серологическую диагностику, так как основан на обнаружении специфических иммуноглобулинов IgM, которые появляются при первой встрече с возбудителем.

VII. Реакции нейтрализации

Этот тип иммунологических реакций, основан на способности антител специфически подавлять (нейтрализовать) биологическую активность возбудителя, или его токсинов в различных тест-системах: в организме животных, в куриных эмбрионах, культурах клеток или каким-то иным способом. Например, для оценки эффективности иммунизации против дифтерии и столбняка определяют уровни антитоксинов в сыворотке крови привитых по их способности нейтрализовать биологическое действие определенной дозы токсина (реакция Шика). Однако реакции нейтрализации применяют и с диагностическими целями. Особенно широкое применение они получили в вирусологической практике, как для серологической диагностики вирусных заболеваний, так и для идентификации вирусов. С этой целью, используют реакции нейтрализации роста, вирусов в культуре клеток, подавления бляшкообразования, гемадсорбции, торможения гемагглютинации (РТТА) и др.

До тех пор. пока не была выяснена химическая природа антител, полагали, что каждая, реакция иммунной сыворотки опосредуется особым видом антител, которые получили соответственно название агглютининов, преципитинов, опсонинов, антитоксинов и т. п. Хотя, эта названия сохранились, они имеют чисто феноменологическое значение, т. е. отражают конечный результат взаимодействия антитела с антигеном. В настоящее время уже ясно, что нет специальных антител - агглютининов, преципитинов и т. д., а есть 5 классов иммуноглобулинов. Специфичность антител, относящихся к любому классу иммуноглобулинов, определяется структурой его активного центра, причем антитела данной специфичности могут относиться к разным классам. Конечный исход взаимодействия антигена с антителами зависит от природы антигена (корпускулярный - агглютинация, растворимый - преципитация); от участия системы комплемента (бактериолиз, бактерицидное действие); макрофагов; от того, к какому классу иммуноглобулинов относится данное антитело; от свойств его Fc-фрагмента. Разные классы иммуногло­булинов в неодинаковой степени участвуют в различных иммунологических реакциях.

Например, в реакциях агглютинации наиболее активны, антитела, относящиеся к IgM и IgG, в реакции связывания комплемента участвуют главным, образом антитела IgG, а в реакции лизиса с участием лизоцима и комплемента — только IgA.

VIII. Иммуноблотинг

Современный высокочувствительный метод идентификации белков, в том числе вирусных антигенов. Метод основан на комбинации гельэлектрофореза и реакции антиген-антитело. Высокая степень разрешения достигается за счет электрофоретического разделения белков, гликопротеинов и липопротеинов и максимальной специфичностью детектирующих иммунных сывороток или моноклональных антител. В оптимально отработанных условиях иммуноблотингом можно обнаруживать антиген в количествах менее 1 нг в испытуемом объеме. Технически иммуноблотинг выполняется в три этапа:

Первый этап - подлежащие анализу белки подвергаются разделению в полиакриламидном геле в присутствии денатурирующих веществ.

Второй этап - разделенные белки переносятся с геля путем наложения (блотинга) на нитроцеллюлозный фильтр и фиксируются на нем; при переносе сохраняются количественные соотношения белков;

Третий этап - на фильтры наносятся детектирующие поли- или моноклональные антитела, содержащие радиоизотопную или ферментную метку; для обнаружения связавшихся антител применяют также антивидовую меченую сыворотку, иными словами, на заключительном этане блотинг аналогичен твердофазным иммунологическим тестам.

Иммуноблотинг достаточно широко используется в исследованиях строения вирусов гепатитов, в частности, для установления антигенного родства между отдельными штаммами.

IX. Тонкослойный иммунный анализ с аутосывороткой (ТИА)

Чашки Петри ополаскивают этиловым спиртом, высушивают на воздухе и заливают агаром с толщиной слоя 3 мм. В агаре делают 3 лунки диаметром 3 мм. В каждую лунку вносят по 0,025 мл сыворотки крови исследуемого больного. Чашки Петри выдерживают при температуре 37 С в течение 48 ч, а затем лунки отмывают водой.

В одну лунку вносят 0,025 мл антигена описторхисов (для обнаруженя Ат в сыворотке больного). В другую лунку вносят 0,025 мл надосадочной жидкости фекалий больного (для получения надосадочной жидкости 1 г фекалий больного помещают в центрифужную пробирку, добавляют 9 мл 0,85% раствора хлорида натрия). Содержимое перемешивают и кипятят над пламенем спиртовки 5 мин.) В третью лунку вносят 0.025 мл изотонического раствора хлорида натрия (контроль).

Чашки закрывают и выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем агар удаляют, чашки ополаскивают водой и высушивают в токе воздуха. Чашки экспонируют над водяной баней при температуре 56 С в течение 1 мин на расстоянии 8-10 см от поверхности воды. Реакция считается положительной, если в месте контакта сыворотки и с надосадочной жидкостью фекалий, и с описторхозным антигеном образовались крупные капли конденсата, а на других, не сенсибилизированных сывороткой участках, - мелкие капли.

Таким образом, реакция ТИА считается положительной в случае обнаружения и антигенов описторхисов в фекалиях, и противоописторхозных антител в сыворотке крови. Используется в диагностике описторхоза.

Полимеразная цепная реакция

Метод цепной полимеразной реакция (ПЦР) - один из наиболее перспективных способов исследования в современной биологии и медицине. Он может быть использован для выявления любых генов, любых фрагментов нуклеиновых кислот. В его основе лежит способность однонитевых молекул нуклеиновых кислот вступать во взаимодействие с комплементарными нитями и образовывать двунитевые гибридные молекулы. Исследуемую клеточную суспензию лизируют для высвобождения нуклеиновых кислот. После этого двухцепочечную ДНК предварительно денатурируют, а образующиеся одноцепочечные молекулы переносят на мембрану, где они ковалентно связываются с ДНК-зондом, который представляет собой меченные изотопом или ферментом денатурированные молекулы нуклеиновой кислоты. Гибридизация происходит лишь в том случае, если между зондом и иммобилизованной на мембране нитью ДНК имеется гомология.

Аллергологические методы.