Получено: 4 января 2009 года

Фармации и Фармакологии

JPP 2009, 61: 767–774

©2009 Авторы

Получено: 4 января 2009 года

Принято в печать: 2 марта 2009 года

DOI 10.1211/jpp/61.06.0009

ISSN 0022-3573

Защитное действие препарата JBP485 при повреждениях печени у мышей, вызванных приемом конканавалина А

Тао Ян^а, Цзинцзин У^а, Чанюань Ван^а, Ци Лю^а, Сяочи Ма^а, Цзиньюн Пэн^а, Тайичи Каку^б, Кэсинь Лю^а

а – фармацевтический институт, Далянский медицинский институт, Далянь, Ляонин, Китай и b Джапан Байопродактс Индастри Ко Лтд, Томигая, Сибуа-ку, Токио

Резюме

Цели исследования.Впервые цикло-транс-4-L- гидроксипропил- L – серин (JBP485)был выделен из препарата «Лаеннек» (Laennec) (гидролизат плаценты человека). Мы решили оценить противогепатитный механизм препарата JBP485, чтобы разработать новый препарат для лечения гепатита.

Методы.Мы исследовали гепатопротекторное действие препарата JBP485 при иммунно-опосредованном поражении печени у мышей, вызванном приемом конканавалина А (Кон А). Мыши получали препарат JBP485 до и после инъекции Кон А (10 мг/кг). Через восемь часов после введения Кон А определяли активность цитозольных ферментов (аланин аминотрансфераза, лактат дегидрогеназа) в сыворотке крови, а также активность или концентрацию ферментов (супероксиддисмутаза, малоновый диальдегид, миелопероксидаза, оксид азота) в гомогенате печени. Гистологические изменения исследовали путем анализа срезов печени. С помощью иммунногистохимического анализа определяли влияние препарата JBP485 на фактор некроза опухоли альфа (ФНО-α) и молекулу межклеточной адгезии - 1 (ICAM-1, intercellular adhesion molecule - 1) в печени. Фрагментацию ДНК гепатоцитов исследовали методом агарового электрофореза, а транскрипцию генов bax и bcl-2 определяли с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией.

Основные результаты.Кон А повышал активность цитозольных ферментов и ферментов в гомогенате печени, а также концентрацию ФНО-α и ICAM-1, однако прием препарата JBP485 снижал эти показатели. Кроме этого, прием препарата JBP485 значительно подавлял повышение фрагментации ДНК и уменьшение мРНК bcl-2/bax, вызванное приемом Кон А.

Выводы.Полученные результаты показывают, что иммунно-опосредованное повреждение печени можно предотвратить с помощью JBP485 благодаря иммунномодулирующему воздействию на Т-клетки молекулы адгезии, а также благодаря антиоксидантному действию и подавлению апоптоза.

Ключевые слова:апоптоз, конковалин А, гепатит, JBP485, Лаеннек.

Введение

Экстракт человеческой плаценты (ЭЧП) используют для лечения ряда заболеваний печени, в том числе гепатита и цирроза⁽¹⁾. Лаеннек (торговое наименование гилролизата человеческой плаценты) производится компанией Джапан Байопродактс Индастри Ко Лтд (Токио, Япония) путем очищения экстракта человеческой плаценты. В Японии препарат используют в медицине для лечения хронического повреждения печени в результате гепатита в течение более, чем 40 лет⁽²⁾. Препарат JBP485 (Рисунок 1), дипептид, одно из соединений, выделенных из Лаеннека; его получают химическим путем методом энантиоселективного синтеза. Наш предварительный эксперимент показал, что препарат JBP485 отлично всасывается из желудочнокишечного тракта⁽²⁾ и обладает противогепатитным действием при токсическом поражении печени, вызванном препаратом конканавалин А (Кон А)⁽³⁾. Это позволяет предположить, что препарат JBP485 распознается системой транспортировки пептидов в желудочнокишечном тракте. Таким образом, важно подробно исследовать противогепатитный молекулярный механизм препарата JBP485 для последующей разработки нового противогепатитного препарата для приема внутрь.

Исследование проводили на хорошо описанной мышиной модели: вызывали Т-зависимое повреждение печени путем инъекции Т-клеточного митогенного растительного лектина – конканавалина (Кон А), - что приводило к развитию молниеносного гепатита в течение 8 часов⁽⁴⁾. Модель повреждения печени, вызванного инъекцией Кон А мышам, считается подходящей для изучения иммунно-опосредованного заболевания печени.

В настоящем исследовании мы изучали гепатопротекторное действие препарата JBP485 при иммунно-опосредованном повреждении печени у мышей для определения противогепатитного молекулярного механизма.

Рисунок 1.Химическая структура препарата JBP485.

Материалы и методы

Реактивы

Препарат JBP485 закупили в компании Джапан Байопродактс Индастри Ко Лтд (Токио, Япония). Кон А и коллагеназу приобрели в компании Вако Пьюэ Кемикал Индастриз Лтд (Осака, Япония). Антитела к фактору некроза опухоли альфа (ФНО-α) и молекуле межклеточной адгезии - 1 (ICAM-1) приобрели в компании Бостер Байотекнолоджи Ко Лтд (Ухань, Китай). Реагенты для фрагментации ДНК и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) приобрели в компании ТаКаРа Байотекнолоджи (Далянь) Ко Лтд (Далянь, Китай). Информация о других реактивах будет приведена далее.

Животные

Самок мышей линии BALB/c с массой тела 20-24 г (получены из Центра экспериментальных животных Далянского медицинского университета, Далянь, Китай) содержали при температуре 23±2^оС, 12-ти часовом световом цикле, при относительной влажности 50±5% на протяжении всего исследования. У всех мышей был свободный доступ к воде и корму. Все протоколы эксперимента были одобрены Этическим комитетом по вопросам обращения с животными Далянского медицинского университета в соответствии с китайским правительственным Комитетом по контролю и надзору за экспериментами с участием животных.

Статистический анализ

Статический анализ проводили с помощью программы SPSS (версия 9, SPSS, Чикаго, США). Все данные представлены в виде среднего± стандартная ошибка средней n отделных экспериментов. Группы данных анализировали с помощью дисперсионного анализа с использованием критерия Стьюдента (односторонний критерий). Различие в Р<0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

Обозначения

ALT	АЛТ	U/mg protein	Ед/мг белка
LDH	ЛДГ	MDA	МДА
U/l	Ед/л	nmol/mg protein	нмоль/ мг белка
Normal	Контрольная группа	MPO	МПО
Con A	Кон А	U/g	Ед/г
Con A+JBP485	Кон А + JBP485	Nitrite	нитрит
SOD	СОД	µmol/g protein	Мкмоль/г белка

Рисунок 2.Влияние препарата JBP485 на маркеры повреждения печени у мышей. Влияние препарата JBP485 (25 мг/кг) на аланин аминотрансферазу (АЛТ) (а), лактат дигидрогеназу (ЛДГ) (b), супероксиддисмутазу (СОД) (c), малоновый диальдегид (МДА) (d), миелопероксидазу (МПО) (e), нитрит (f) сыворотки крови у мышей линии BALB/c определяли через 8 ч после внутривенного введения конканавалина А (Кон А) (10 мг/кг). Все данные представлены в виде среднего± стандартная ошибка средней, n=8 для каждой группы при анализе АЛТ и ЛДГ, n=6 для каждой группы при других исследованиях. # Р<0,05, ##Р<0,01 в сравнении с группой Кон А.

Обозначения

Normal	Контрольная группа
Con A	Кон А
Con A+JBP485	Кон А + JBP485
β-actin	β-актин
bcl-2mRNA	мРНК bcl-2
bax mRNA	мРНК bax
Relative RNA	Относительная РНК

Рисунок 7.Влияние препарата JBP485 на экспрессию мРНК генов bcl-2 и bax, вызванную введением Кон А, в гепатоцитах мышей. (а) Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) влияния препарата JBP485 (25 мг/кг) на экспрессию мРНК генов bcl-2 (слева) и bax (справа), вызванную введением Кон А. М – маркер. Полоса А – группа Кон А (10 мг/кг), полоса В – группа Кон А+ JBP485 (25 мг/кг), полоса С – контрольная группа. (b) Полуколичественный анализ продуктов ОТ-ПЦР. Данные денситометрической ОТ-ПЦР стандартизировали с сигналами β-актина. (с) Соотношение мРНК bcl-2 к мРНК bax. Результаты представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего, n=3 в каждой группе. *Р<0,05 в сравнении с контрольной группой, # Р<0,05, ##Р<0,01 в сравнении с группой Кон А.

Обсуждение

Гепатит, вызванный приемом конканавалина А, у мышей и вирусный гепатит у людей имеют несколько схожих проявлений, в том числе воспалительную инфильтрацию, наличие ФНО-α, интерферона-γ и NO в сыворотке крови, признаки апоптоза, повышение экспрессии Fas, предполагаемое участие цитотоксических T-клеток.^{(10, 11)} В целом, гепатит, вызванный Кон А у мышей, считается подходящей моделью для исследований терапии иммунно-опосредованного повреждения печени, в том числе повреждения печени вследствие вирусного гепатита у человека.

В настоящем исследовании мы показали, что препарат JBP485 оказывает защитное (гепатопротекторное) действие при иммунно-опосредованном гепатите, вызванном у мышей приемом препарата Кон А. Наши результаты показывают, что JBP485 значительно понижает в сыворотке крови уровень АЛТ и ЛДГ, которые указывают на повреждение клеточной мембраны. Кроме того, морфологическое исследование и анализ МПО позволяют предположить, что препарат JBP485 предотвращал повреждение печени, вызванное Кон А, а также воспалительную инфильтрацию у мышей.

Для дальнейшего исследования защитного механизма препарата мы определили активность СОД и продукцию МДА в тканях печени. Мы выявили, что JBP485 предотвращает снижение СОД и снижает уровень МДА в тканях печени мышей, получивших Кон А. Это позволило предположить, что после приема внутрь препарат JBP485 производит антиоксидантное действие, что частично объясняет защитное действие при экспериментально спровоцированном гепатите.

Мы также обнаружили, что препарат JBP485 способен понижать уровень нитрита в тканях печени мышей, получивших Кон А, что означает, что препарат JBP485 может ингибировать гиперэкспрессию NO, полученного из индуцибельной синтазы оксида азота (iNOS) в тканях печени (iNOS - одна из трех изоформ NOS, которую индуцируют цитокины (например ФНО-α и ИФ-γ), и которая может производить большое количество NO. Как показано в предыдущих исследованиях, повреждение печени, как и ее защита, связаны с NO.)¹² Это защитное действие отмечалось при алкогольном гепатите, после частично гепатоэктомии а также после лечения GalN/ФНО-α или CCl ₄. Гепатотоксический эффект экспрессии iNOS отмечался при геморрагическом шоке, ишемии/реперфузии, при наличии в крови эндотоксинов или после лечения GalN/липополисахаридами.⁽¹³⁾ Гиперэкспрессия iNOS отмечалась при многих острых и хронических заболеваниях (например при септическом шоке, геморрагическом шоке и гепатите). Исследования показали, что чрезмерная продукция NO из iNOS играет важную роль в индуцировании токсического поражения печени.^{(6, 13)} NO опосредует поражение тканей различными путями, в том числе путем ингибирования митохондриального дыхания, инактивации ингибиторов протеиназы и производства свободных радикалов.⁽¹⁴⁾ В настоящем исследовании на мышах мы показали, что препарат JBP485 подавляет производство нитрита в тканях печени, по сравнению с группой Кон А, что означает, что механизм гепатопротекторного действия препарата JBP485 при гепатите, вызванном Кон А, включает ингибирование продукции NO, снижая, таким образом, токсичность для гепатоцитов у мышей, получивших Кон А.

ФНО-α – это центральный медиатор воспаления печени при гепатите, вызванном Кон А.^{(15, 16)} Как недавно сообщалось, гепатит, вызванный Кон А, сильно зависит от ФНО-α, выделяемого звездчатыми эндотелиоцитами.⁽¹⁷⁾ Доказано, что ингибирование ФНО-α антителами или растворимым рецептором-приманкой (decoy receptor) оказывает положительные терапевтический эффект на пациентов, страдающих от иммунно-опосредованных заболеваний, таких, как воспалительная болезнь кишечника или ревматоидный артрит.⁽⁹⁾ В нашей модели гепатита, индуцированного Кон А мы исследовали терапевтическую эффективность препарата JBP485 у крыс и мышей с острым воспалительным поражением печени, вызванным приемом препарата Кон А.⁽³⁾ Один из возможных механизмов противовоспалительного действия препарата JBP485 состоит в том, что он может ингибировать продукцию и секрецию ФНО-α, чтобы, в свою очередь, ингибировать миграцию Т-лимфоцитов, поскольку индуцирование иммунно-опосредованного поражения печени требует высвобождения и миграции активированных Т-клеток; препарат JBP485 может предотвратить это раннее событие в развитии повреждения печени, индуцированном Кон А. Другой механизм – непрямое ингибирование продукции NO и свободных радикалов, чтобы защитить гепатоциты от повреждения печени, индуцированного приемом Кон А.

Механизм действия препарата JBP485 при предотвращении повреждения печени, индуцированного приемом Кон А, также включает ингибирование экспрессии ICAM-1. Экспрессия ICAM-1 гепатоцитами связана с тяжестью воспалительного процесса в печени; гепатоциты экспрессируют ICAM-1 и молекулу адгезии сосудистой клетки-1 после стимуляции лимфокинами (например, ФНО-α), а затем Т-лимфоциты связываются с гепатоцитами через эти молекулы адгезии. Индуцирование и развитие воспаление требует адгезии лимфоцитов с клетками-мишенями. Кон А вызывает прямые биологические изменения в гепатоцитах, что приводит к повреждению печени активированными лимфоцитами.⁽¹⁸⁾ Провоспалительное состояние – это ранний этап воспалительного каскада, который вызывает притяжение, адгезию и субэндотелиальную миграцию мононуклеальных клеток в печень.⁽¹⁶⁾ Экспрессия адгезивных молекул – это важный этап развития проо-воспалительного состояния в эндотелиальных клетках. При поражении печени у мышей, вызванном приемом препарата Кон А мы выявили гиперэкспрессию ICAM-1, которая снижалась в группе, получавшей JBP485. Это означает, что препарат JBP485 может подавлять адгезию лимфоцитов с эндотелием и ингибировать миграцию лимфоцитов из кровеносного русла и проникновение субэндотелия.

Многие факторы могут ингибировать апоптоз гепатоцитов, например свободные радикалы, NO, ФНО-α.^{(14, 15, 19)} Мы обнаружили, что препарат JBP485 значительно ингибировал фрагментацию ДНК, индуцированные Кон А. Чтобы определить точный молекулярный механизм ингибирования фрагментации ДНК препаратом JBP485, мы исследовали экспрессию генов bax и bcl-2, связанных с апоптозом, которые принадлежат к семейству генов bcl-2. Модуляция экспрессии семейства генов bcl-2 – это важный молекулярный механизм апоптоза клеток, который играет решающую роль при обычном апоптозе.⁽¹⁹⁾ Биологическая функция белка bcl-2 – оказаывать защитное действие при воздействии факторов апоптоза, препятствует апоптозу и продлевает срок жизни; напротив, белок bax, который структурно очень напоминает bcl-2, содействует апоптозу семейства белков bcl-2.^{(19, 20)} bax инактивирует bcl-2, связываясь с ним, образуя гетеродимер. Таким образом, соотношение мРНК bcl-2/bax – это ключевой фактор, определяющий, будет ли происходить апоптоз в клетках, которые подверглись действию многочисленных повреждающих факторов.⁽²⁰⁾ Наше исследование позволяет предположить, что препарат JBP485 может защищать гепатоциты от апоптоза, в основном, благодаря апрегуляции экспрессии гена bcl-2, увеличивая соотношение мРНК bcl-2/bax.

Выводы

Наши данные показывают, что препарат JBP485 оказывает гепатопротекторное действие при повреждении печени у мышей, вызванном препаратом Кон А. Механизм такого действия может объясняться 1) ингибированием экспрессии нескольких воспалительных медиаторов и цитокинов, 2) антиоксидантным действием, связанным с СОД и МДА, 3) действием против апоптоза гепатоцитов путем снижения фрагментации ДНК и апрегуляции экспресии гена bcl-2.

Заявления

Конфликт интересов

Автор (ы) заявляет (ют) об отсутствии конфликта интересов

Финансирование

Данная работа проведена благодаря гранту Национального фонда естественных наук Китая (№30672498) и технологического отдела Фонда естественных наук провинции Ляонин (№2004225003-6). Особая благодарность компании Джапан Байопродактс Ко Лтд за финансовую помощь.

Список литературы.

1. Liu KX et al. Human placental extract stimulates liver regeneration in rats. Biol Pharm Bull 1998; 21: 44–49.

2. Liu KX et al. Hydroxyprolylserine derivatives JBP923 and JBP485 exhibit the antihepatitis activities after gastrointestinal absorption in rats. J Pharmacol Exp Ther 2000; 294: 510–515.

3. Wu JJ et al. Protective effect of JBP485 on concanavalin A-induced hepatocyte toxicity in primary cultured rat hepatocytes. Eur J Pharmacol 2008; 589(1–3): 299–305.

4. Tiegs G et al. A T cell-dependent experimental liver injury in mice inducible by concanavalin A. J Clin Invest 1992; 90: 196–203.

5. Okamoto T et al. Aminoguanidine prevents concanavalin A-induced hepatitis in mice. Eur J Pharmacol 2000; 396: 125–130.

6. Ksontini R et al. Disparate roles for TNF- a and Fas ligand in concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol 1998; 160: 4082– 4089.

7. Ajuebor MN et al. C-C chemokine ligand 2/monocyte chemoattratant protein-1 directly inhibits NKT cell IL-4 production and is hepatoprotective in T cell-mediated hepatitis in the mouse. J Immunol 2003; 170: 5252–5259.

8. Hentze H et al. Depletion of hepatic glutathione prevents death receptor-dependent apoptotic and necrotic liver injury in mice. Am J Pathol 2000; 156: 2045–2056.

9. Wolf AM et al. The kinase inhibitor imatinib mesylate inhibits TNF- a production in vitro and prevents TNF-dependent acute hepatic inflammation. Proc Natl Acad Sci 2005; 102: 13622–

13627.

10. Kusters S et al. Interferon gamma plays a critical role in T-cell- dependent liver injury in mice initiated by concanavalin A. Gastoroenterology 1996; 111: 462–471.

11. Yoneda M et al. A novel therapy for acute hepatitis utilizing dehydroepiandrosterone in the murine model of hepatitis. Biochem Pharmacol 2004; 68: 2283–2289.

12. Li J, Billiar TR. Determinants of nitric oxide protection and toxicity in the liver. Am J Physiol 1999; 276: G1069–G1073.

13. Sass G et al. Inducible nitric oxide synthase is critical for immune-mediated liver injury in mice. J Clin Invest 2001; 107: 439–447.

14. Marshall HE et al. Nitrosation and oxidant in the regulation of gene expression. FASEB J 2000; 14: 1889–1900.

15. Mizuhara H et al. T cell activation-associated hepatic injury: mediation by tumor necrosis factor and protection by interleukin 6. J Exp Med 1994; 179: 1529–1537.

16. Bruck R et al. Allicin, the active component of garlic, preventsimmune-mediated, concanavalin A-induced hepatic injury in mice. Liver Int 2005; 25: 613–621.

17. Schumann J. Importance of Kupffer cells for T-cell-dependent liver injury in mice. Am J Pathol 2000; 157: 1671–1683.

18. Wang ZZ et al. Protection of Veratrum nigrum L.var. ussuriense Nakai alkaloids against ischemia-reperfusion injury of the rat liver. World J Gastroenterol 2007; 13: 564–571.

19. Gao H, Zhou YW. Inhibitory effect of picroside P onhepatocyte apoptosis. Acta Pharmacol Sin 2005; 26: 729–736.

20. Cheng BH et al. D - b -Hydroxybutyrate inhibits the apoptosis of PC12 cells induced by 6-OHDA in relation to up-regulating the ratio of Bcl-2/Bax mRNA. Auton Neurosci-Basic 2007; 134:38–44.

Фармации и Фармакологии

JPP 2009, 61: 767–774

©2009 Авторы

Получено: 4 января 2009 года