Роль фагоцитоза в противовирусном иммунитете

Ранее счи­талось, что роль фагоцитоза в противовирусном иммунитете не имеет существенного значения. Вирусы легко адсорбируются на поверхности лейкоцитов и проникают в них. Однако последую­щего разрушения их не происходит, так как фагоциты оказа­лись не способными переваривать захваченные ими вирионы. Некоторые вирусы даже могут репродуцироваться в лейкоцитах (вирусы африканской чумы свиней, чумы крупного рогатого скота). Однако отрицать роль фагоцитарных клеток в противо­вирусном иммунитете нет основания. В защите организма от вирусных инфекций фагоцитоз играет важную роль, но прояв­ляется фагоцитозом не вирионов, а инфицированных ими чув­ствительных клеток, эритроцитов, тромбоцитов и других час­тиц, доступных для фагоцитоза.

По новой классификации фагоцитарные клетки именуют «системой мононуклеарных фагоцитов», которая включает промоноциты костного мозга (клетки-предшественники), моноциты периферической крови (подвижные клетки, образуемые в ре зультате деления промоноцитов) и тканевые макрофаги, кото­рые находятся в печени, селезенке, лимфатических узлах, кост­ном мозге, нервной системе.

Освобождение крови от посторонних частиц и бактери (клиренс) осуществляется макрофагами печени (купферовские клетки) и красной пульпой селезенки, причем скорость очище­ния крови от вирусов зависит как от биологических свойств вирусов (их размеров, вирулентности) и величины вводимой дозы, так и от степени резистентности организма, активности его клеточных и гуморальных факторов иммунитета.

Устойчивость вирусов к фагоцитозу не абсолютна; по этому свойству между ними установлены существенные различия. Крупные вирусы эктромелии, осповакцины, простого герпеса и везикулярного стоматита выводятся из крови быстрее, чем мел­кие энтеровирусы. Специфические противовирусные антитела вызывают агломерацию вирионов и их опсонизацию. Такие нейтрализованные антителами агломераты вирионов захваты­вают макрофаги и переваривают их. Комплемент повышает прочность связи антител с вирусами, способствует укрупнению агломерата вирионов, их опсонизации, клиренсу (очищению) крови и фагоцитозу, Однако в отличие от бактерий вирусы бо­лее устойчивы к ферментам фагоцитов, поэтому процесс пере­варивания их фагоцитами происходит не во всех случаях.

В процессе иммунизации организма макрофаги подвергают­ся специфической перестройке. Она выражается в их способно­сти более быстро разрушать фагоцитированный вирус, в боль­шей устойчивости к цитопатическому действию вируса гриппа, а также в неспособности поддерживать синтез V- и S-антигенов вируса и давать гемадсорбцию по сравнению с макрофагами, не подготовленными иммунизацией животных. Установлено, что противовирусная активность различных категорий фагоцитар­ных клеток неодинакова, Полиморфноядерные нейтрофилы им­мунизированных кроликов не разрушают вирус осповакцины, а мононуклеары тех же животных не только фиксируют, но и дезинтегрируют его. Ряд авторов показали, что очищение кро­ви от энтеровирусов (Коксаки группы В и А9, полиомиелита) обусловлено функцией макрофагов, которые у иммунных жи­вотных более активно переваривают вирус, Если последний предварительно обработать (сенсибилизировать) специфически­ми гамма-глобулинами, то процесс ферментативного перевари­вания его может происходить и в макрофагах нормальных жи­вотных. Фагоцитированные вирусы гибнут под влиянием кисло­го содержимого вакуоли и ферментов фагоцитов.

Таким образом, более ранние представления о принципиаль­ном различии вирусов и бактерий по их отношению к фагоци­тозу не являются абсолютными. Оказалось, что и некоторые бактерии (брюшного тифа, инфлюэнцы, токсигенные штаммы стафилококков, гонококки) сохраняют жизнеспособность, буду­чи фагоцитированными.

Однако клеточные факторы иммунитета не ограничены толь­ко фагоцитозом, как предполагалось, раньше. Клетки ретикулоэадотелиальной системы продуцируют антитела, интерферон, комплемент, энзимы и другие вещества, являющиеся фокторами иммунитета.

Интерферон

Роль интерферона. Открытие интерферона — это новая глава иммунологии — учения о невосприимчивости организма к ин­фекциям. Интерферон — особый противовирусный белок, про­дуцируемый зараженными клетками или целым организмом. Открыли его английские вирусологи Айзеке и Линденман (1957). Этому открытию предшествовало большое число работ по вирусной интерференции. Собственно, из наблюдений за этим биологическим феноменом и родилась идея поиска специфиче­ского антивирусного белка.

Свойства интерферона. Существует не один интерферон, а интерфероны, т. е. не единый белок, а класс белков, разли­чающихся разной мол. массой и другими параметрами, Интер­фероны, индуцированные вирусами, имеют мол. массу 26— 38×10³ Д, а индуцированные липополисахаридами бактерий — 89—90×10³ Д.

По антигенной специфичности интерфероны делятся на аль­фа (a), бета (b) и гамма (g).

Индукция интерферона. В клетках человека имеется 27 ге­нетических локусов для интерферонов, из которых 14 являются функционирующими. Интерфероны закодированы в генетиче­ском аппарате клетки. Гены, кодирующие фибробластный (b) интерферон, располагаются во 2-й и 9-й и длинном плече 5-й хромосомы, а ген, регулирующий транскрипцию, — в коротком плече той же хромосомы. Ген, детерминирующий восприимчи­вость к действию интерферона, локализован в 21-й хромосоме. Ген для а-интерферона располагается в 9-й хромосоме, для g-интерферона — в 11-й хромосоме.

Система интерферона не имеет центрального органа, так как способностью вырабатывать интерферон обладают все клетки организма позвоночных животных, хотя наиболее активно вы­рабатывают его клетки белой крови.

Интерферон спонтанно не продуцируется интактными клет­ками, и для образования его нужны индукторы, которыми мо­гут быть вирусы, бактериальные токсины, риккетсии, экстрак­ты из бактерий и грибов, фитогемагглютинины, синтетические вещества — поликарбоксилы, полисульфаты, декстраны, но наиболее эффективными индукторами интерферона являются дву-спиральные РНК: двуспиральные вирусные РНК и двуспиральные синтетические сополимеры рибонуклеотидов (поли-ГЦ, поли-ИЦ), убитые и живые вирусы. Индукция интерферона происходит вследствие дерепрессии его генов.

Вирусиндуцированный интерферон имеет два типа — a и b. Индукторами (-интерферона являются фитогемагглютинин (ФГА) и стафилококковый энтеротоксин (СЭА). Индуктор a-интерферона — вирус ньюкаслской болезни, многие вирусы (преимущественно РНК-содержащие), синтетические полирибонуклеотиды (преимущественно двуспиральные) и ряд других веществ. Вирус ньюкаслской болезни используется для промыш­ленного и лабораторного производства лейкоцитарного интер­ферона. Сегодня круг индукторов интерферона чрезвычайно широк. Однако ни один из известных интерфероногенов в полном объеме не отвечает всем критериям, предъявляемым к ним в медицинской и ветеринарной практике. Одни интерфероногены индуцируют образование интерферона in vivo, другие же in vivo и in vitro. Другие вещества индуцируют образование эндогенного интерферона in vivo при введении в организм.

Хорошим индуктором интерферона является двуспиральная РНК тогда как вирусная ДНК не обладает интерфероноген-ными свойствами. К числу наиболее изученных и перспективных не антигенных индукторов интерферона in vivo и in vitro относится синтетическая двуспиральная РНК, состоящая из комплекса полиинозиновой и полицитидиловой кислот —по­ли (И) и поли (Ц). В настоящее время больше ориентируются на природные двуспиральные РНК, и в частности на реплика-тивную форму РНК бактериофагов (фага 2). По активности этот индуктор не уступает комплексу полиинозиновой и поли­цитидиловой кислот — поли (И) и поли (Ц). В качестве индук­тора интерферона в клеточных культурах животного происхож­дения используют вирусы растений, которые обеспечивают бо­лее продолжительный срок интерферонообразования.

При индукции интерферонов синтезируется два или более его типов. Так, при индукции ИФН на лимфобластах образует­ся 87% лейкоцитарного и 13% фибробластного интерферона, а на фибробластах имеют место обратные соотношения. Между тремя типами ИФН-ов могут существовать синергетические взаимодействия.

Из вирусов наиболее активные индукторы — миксо- и арбовирусы. Интерфероногенность вирусов возрастает с уменьшени­ем их вирулентности для организма и цитоцидного действия на культуру клеток. Поэтому лучше использовать апатогенные живые вакцинные штаммы (против гриппа, свинки, полиомие­лита, ньюкаслской болезни и др.). К слабым индукторам отно­сятся вирусы герпеса, адено- и онковирусы.

Индукторы интерферона невирусной природы (бактериаль­ные эндотоксины, полисахариды, нуклеиновые кислоты микроб­ного происхождения) стимулируют более быстрое и кратковре­менное накопление в организме «тяжелого» интерферона с мол. массой 20×10³ Д. В тканевых культурах вирусы индуциру­ют «легкие», а в организме животных — «тяжелые» интерфе-роны.

В настоящее время аэрозольный способ введения индукторов интерферона применяется для профилактики респираторных вирусных инфекций у человека.

Помимо применения готовых препаратов интерферона, уже нашедших применение в медицине, сейчас в клиническую прак­тику внедряются перспективные индукторы эндогенного интер­ферона, поскольку последний дает более значительный защит­ный эффект при вирусных болезнях, чем экзогенный (Ф. И. Ер­шов, 1985).

Механизм образования интерферона в клетке. Генетически информация для продукции интерферона содержится в ДНК клетки, и для его образования в клетке необходим предвари­тельный синтез информационной РНК на матрице клеточной ДНК, в первые часы после заражения. Репликацию иРНК для интерферонов катализирует клеточная РНК-полимераза. Из клеток фибробластов эмбрионов кур выделены иРНК интер­ферона и репрессоры его продукции. Установлено, что накоп­ление РНК репрессора происходит несколько раньше, чем РНК интерферона. Время трансляции РНК интерферона составляет 25—30 мин, а РНК репрессора — 30—35 мин (Э. Б. Тазулахова, В. В. Зайцева, Ф. И. Ершов, 1980). Регуляция индукции и репрессии синтеза интерферона имеет свой особый механизм, основанный на концепции Жакоба и Мано относительно регуляторных механизмов в клетке (репрессия, индукция).

Механизм интерферонообразования делят на несколько пе­риодов:

I фаза — индукция интерферона (процесс чувствителен к ингибиторам синтеза белка): 1) адсорбция индуктора на по­верхности клетки; 2) «захват» индуктора клеткой; 3) процесс инициации индукции; 4) дерепрессия генов интерферона; 5) транскрипция иРНК для интерферона (иРНК—ИФН);

II фаза — продукция интерферона (процесс чувствителен к ингибиторам синтеза белка): 1) трансляция иРНК—ИФН; 2) пост-1-трансляционные превращения полипептида с образо­ванием интерфероида; 3) гликозилирование интерфероида с об­разованием интерферона; 4) выделение (секреция) интерфе­рона.

Весь интерферон в клетках синтезируется после индукции de novo. Практически все клетки в той или иной мере способны образовывать интерферон, исключая клетки линии Vero.

Схематически механизм продукции интерферона может быть представлен следующим образом:

Промежуток времени между начальным взаимодействием индуктора и клетки (адсорбция индуктора) и появлением ин­терферона, рассматриваемый как lag-период, зависит от харак­тера системы индуктор - клетка. При использовании в качестве индуктора вируса lag-период обычно длится 4—8 ч.

Продукция эндогенного интерферона. Интерферон можно получить через 4 ч после внутривенного введения интерфероногена. Например, сывороточный интерферон образуется in vivo при внутривенном введении мышам вируса ньюкаслской болез­ни или бактериального липополисахарида. Для индукции эндо­генного интерферона используют интерфероногенноактивный вирус. Интерферон образуется быстро, но при острых самосте­рилизующихся вирусных инфекциях обнаруживается в течение сравнительно короткого времени и дольше при хронических инфекциях.

Противовирусная резистентность клеток под влиянием ин­терферона развивается в определенной последовательности. Невосприимчивость клеток к вирусам наступает через 30 мин после контакта с интерфероном а и через 2 ч после контакта с интерфероном g. Далее резистентность повышается и дости­гает Наивысшего значения через 7—9 ч, после чего сохраняется на постоянном уровне.

Механизм антивирусного действия интерферона. Интерферон не влияет на адсорбцию вируса, виропексис, депротеинизацию вирионов, освобождение вирусной нуклеиновой кислоты, ком­позицию вирионов и выход их из клетки. Он не действует на внеклеточный (экстрацеллюлярный) вирус, он подавляет его репродукцию, т. е. действует на вирус опосредованно через чувствительные клетки, в которых не нарушен синтез, клеточ­ной РНК и клеточных белков. Поэтому актиномицин Д, подав­ляющий синтез клеточных РНК и белка, подавляет и действие интерферона.

Интерферон не обладает видоспецифическим антивирусным действием. Будучи индуцирован вирусом ньюкаслской болезни, № подавляет репродукцию не только этого вируса, но и целого ряда других. Однако он обладает видотканевой специфичностью, т. е. более активен в той биологической системе, в которой ре­продуцирован. В последние годы накапливается все больше данных, противоречащих представлениям о видовой специфич­ности интерферона. Так, человеческий лимфобластоидный ин­терферон, полученный в культуре клеток Namalva и индуциро­ванный вирусом Сендай, проявляет одинаково высокую анти­вирусную активность в культурах клеток обезьян, легкого плода человека и эндотелиальных клеток аорты морских свинок. Или, например, показана способность лейкоцитов крови свиней про­дуцировать интерферон такой же активности, как и нативный человеческий лейкоцитарный интерферон.

Интерферон связывается с клеточными рецепторами, нахо­дящимися на плазматической мембране, что служит сигналом для депрессии соответствующих генов. В результате индуциру­ется синтез особой пpoтеинкиназа PKds, которая присутствует и следовых количествах во всех клетках млекопитающих и активирусется низкими концентрациями двуспиральной РНК, а в зараженных вирусами клетках — вирусными репликативными комплексами.

Протеинкиназа фосфорилирует а-субъединицу инициирую­щего фактора трансляции elF-2, и фосфорилирование блокиру­ет активность инициирующего фактора- В результате иРНК, связанная с Инициирующим комплексом, не может связаться с большой рибосомальной субъединицей и поэтому ее трансляция блокируется. Инициирующий фактор elF-2 в одинаковой степе­ни необходим дли Трансляции как клеточных, так и вирусных йРЙК, однако преимущественно блокируется трансляция ви­русных иРНК, связанных с вирусными двуспиральными РНК-сТруктурами; в результате Локальной активации протеинкиназы.

В Обработанных интерфероном клетках индуцируется синтез фермента сйнтетазЫ, которая катализирует продукцию, 2,5-оЛИ-гоаденйЛов&й кислоты, переключающей действие клеточных нуклеаз на рйзруЩение вирусных иРНК. Таким образом, вирусные иРНК подвергаются разрушению нуклеазами.

Блокирование интерфероном стадии инициации трансляции и разрушение иРНК обусловливают его универсальный механизм действия при инфекциях, вызванных вирусами с разным генети­ческим материалом.

Интерферон защищает клетки от вирусной инфекции лишь в том случае, если воздействует на них до контакта с вирусом. В организме и в клеточных культурах он оказывает как имму­ностимулирующее, так и иммуносупрессивное действие, причем последнее особенно выражено при использовании концентриро­ванного препарата. Интерферон активизирует эффекторные клетки иммунной защиты, главным образом макрофаги и кил-лерные клетки, повышая их способность убивать опухолевые клетки. Он тормозит рост пролиферирующих клеток, в том чис­ле опухолевых.

В антивирусном состоянии клеток под влиянием интерфе­рона ведущую роль играет синтез двух ферментов: синтетазы, осуществляющей после активации эндонуклеазы деградацию вирусных РНК, и протеинкиназы, ингибирующей начальные этапы синтеза вируса. Ключевым моментом в механизме дей­ствия интерферона является фосфорилирование малой субъеди­ницы инициирующего фактора трансляции ЕИФ-2, ассоцииро­ванного с рибосомами (A. Ziblestein и др., 1976; J. Cooper и др., 1977). Интерферон ингибирует трансляцию иРНК (в пер­вую очередь вирусных) путем индукции повышенного синтеза дсРНК-зависимых ферментов протеинкиназы (2'—5') АН-оли- госинтетазы.

Практическое применение интерферона.

В практическом использовании интерферона в настоящее время намечаются два пути: применение готового экзогенного гомологичного интерферона и индукция в организме эндоген­ного интерферона. Однако, учитывая выраженную видовую спе­цифичность интерферона для профилактики и лечения виру'сных инфекций, практически может быть использован только эндо­генный интерферон. При этом наилучший защитный эффект получают при меньшем количестве введения в организм препа-рата-индуцента, вызывающего интерферонообразование в орга­низме. Достигается это при аэрозольном способе его введения. Поэтому аэрозольная вакцинация животных и птицы в ряде случаев более эффективна, чем подкожное и внутримышечное применение. Считают, что концентрация интерферона, которая образуется в носовом секрете при заражении авирулентным штаммом ИРТ, достаточна для того, чтобы блокировать или ингибировать заражение телят некоторыми вирусами, вызыва­ющими заболевание верхних дыхательных путей крупного ро­гатого скота.

Доказана передача эндогенного интерферона потомству, что позволяет создавать невосприимчивость мышей-сосунов к неко­торым вирусным инфекциям.

Экзогенный интерферон в терапевтических дозах совершенно безвреден. Ни генетических последствий, ни аллергических ре­акций этот препарат не вызывает. Однако готовый лейкоцитар­ный интерферон не нашел широкого применения из-за выра­женной видовой специфичности. Он активен, если его готовить на лейкоцитах крови людей. Применение экзогенного лейкоци­тарного интерферона оказалось перспективным только при ло­кальных вирусных инфекциях глаз и кожи. В перспективе име­ется более широкая возможность клинического использования интерферона в связи с успешными работами по интеграции ге­на человеческого интерферона в геном Е. coli. Методом генной инженерии уже получен интерферон с активностью 500000 ЕД из 1 л бактериальной культуры.

Данные о применении интерферона для предупреждения гриппа неоднозначны. Основные причины разноречивости оце­нок обусловлены неодинаковой чувствительностью различных штаммов этого вируса к интерферону и отсутствием стандартных схем использования индукторов интерферона.

Динамика накопления эндогенного интерферона и антител у однократно и повторно иммунизированных животных различ­на. Предполагают, что купирование вспышек кори противокоревыми вакцинами происходит не за счет повышения уровня ан­тител, а за счет раннего появления в их организме неспецифи­ческого фактора иммунитета — интерферона.

Важна роль интерферона в выздоровлении организма. Мак­симальное накопление его выражено в период виремии. Он уча­ствует в период, предшествующий накоплению, антител. Начало выздоровления совпадает с усилием способности лейкоцитов продуцировать интерферон. Интенсивность продукции интерфе­рона лейкоцитами отражает не только устойчивость людей к вирусным инфекциям, но и функциональную активность лимфоидной ткани вообще.

Интерферон оказывает противоопухолевое действие при па-рэнтеральном введении в больших дозах, связанное с подавле­нием им цитопролиферативной активности. Интерферон является регулятором различных механизмов иммунного ответа, оказывая стимулирующее или угнетающее действие на иммунные реакции.

В настоящее время человеческий b-интерферон производится в США ген­но-инженерным методом, он оказался эффективным при ревматоидном артри­те. В сочетании с интерлейкином он проходит клинические испытания эффективности в терапии миеломы, лейкоза, рака мочевого пузыря, гепатита В и др.

Получение и титрование интерферона. Его получают in vitro в культурах клеток или во взвесях лейкоцитов, причем если активность культурального интерферона составляет 1:16, то лейкоцитарного—1 : 512, а продуцирован­ного макрофагами— 1 : 2000—1 : 4000. В принципе любые клетки продуцируют интерферон, но более активными из них являются макрофаги. Интерферон а получают в культуре лейкоцитов или клеточной линии Namalwa путем индук­ции вирусом Сендай; интерферон р — в фибробластах при индукции синтети­ческими РНК; интерферон Y — в культурах лейкоцитов, стимулированных митогенами.

Для получения высокоактивных препаратов интерферона каждая клеточ­ная система требует тщательного подбора вируса-индуктора и заражающей дозы вируса. Например, клеточные культуры щитовидной железы человека оказались более пригодными продуцентами интерферона по сравнению с кле­точными культурами фибробластов эмбриона человека и диплоидными клетка­ми. Лейкоциты свиньи хорошо продуцируют интерферон, удельная активность свиного интерферона выше, чем человеческого.

Приложение А

Вопросы для сдачи зачета по дисциплине «Вирусология»

1. Развитие учения о вирусах

2. Вирусология как биологическая наука

3. Связь вирусологии с другими биологическими науками

4. Природа вирусов

5. Основные группы вирусов

6. Химический состав вирусов

7. Вирусные нуклеиновые кислоты

8. Вирусные белки

9. Вирусные липиды

10. Вирусные углеводы

11. Структура вирусов: вирусы с кубическим типом симметрии

12. Структура вирусов: вирусы со спиральным типом симметриии

13. Вирусные липопротеидные оболочки.

14. Структура фагов

15. Номенклатура вирусов

16. Критерии систематики вирусов

17. Краткая характеристика основных структур и свойств ДНК-вирусов

18. Краткая характеристика основных структур и свойств классифицированных семейств РНК- вирусов

19. Предполагаемые семейства Filo- и Birnaviridae

20. Порядки

21. Общее представление о репродукции вирусов

22. Адсорбция вирионов на поверхности клетки

23. Проникновение вирусов в клетку

24. Раздевание вируса в клетке

25. Вторая фаза репродукции вирусов: транскрипция

26. Вторая фаза репродукции вирусов: трансляция информационных РНК

27. Репликация генома ДНК- вирусов

28. Репликация генома РНК - вирусов

29. Синтез вирусных белков

30. Сборка вирусных компонентов

31. Выход вируса из клетки

32. Типы взаимодействия вируса с клеткой

33. Реакция клетки на вирусную инфекцию

34. Патологические изменения в клетке зараженной вирусом

35. Структурная организация генома вируса

36. Мутации у вирусов

37. Спонтанные мутации у вирусов

38. Индуцированные мутации у вирусов

39. Репарация

40. Формы генетических воздействий: рекомбинация

41. Виды и механизмы рекомбинации

42. Формы генетических воздействий: множественная реактивация

43. Формы генетических воздействий: пересортировка ге­нов

44. Формы генетических воздействий: гетерозиготность

45. Формы генетических воздействий: транскапсидация

46. Формы генетических воздействий: кросс-реактивация

47. Формы генетических воздействий: гетерозиготность

48. Негенетические взаимодействия: фенотипическое смешивание

49. Негенетические взаимодействия: негенетическая реактивация

50. Теории происхождения вирусов

51. Прионы

52. Виройды

53. Естественная видовая резистентность

54. Неспецифические общефизиологические реакции: защитная роль температуры и влияние гормонов

55. Не специфические общефизиологические реакции: влияние функции выделительной системы и гуморальные факторы, неспецифической резистентности

56. Интерферон

57. Механизм антивирусного действия интерферона

58. Роль антител в противовирусном иммунитете

59. Факторы клеточного иммунитета

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

Обязательная

1. Основы медицинской бактериологии, вирусологии и иммунологии: Учеб. пособие / Под ред. Г. М. Шуба. - М.: Логос, 2003. - 264c.

2. Практикум по общей вирусологии: Учеб. пособие / Под ред. И. Г. Атабекова. - 2-е изд. , перераб. и доп. - М.: Изд-во МГУ, 2002. - 184c.

Дополнительная

1. Райкис, Б. Н.Общая микробиология с вирусологией и иммунологией (в графическом изображении): Учеб. пособие / Райкис, Б. Н., Пожарский, В. О., Казиев, А. Х. - М.: Триада-Х, 2002. - 352c.