Теории происхождение вирусов
Наши представления о происхождении вирусов претерпели за последние годы значительную эволюцию. Основные гипотезы о происхождении вирусов сводятся к альтернативе:
1) вирусы являются потомками первоначальных форм жизни и
2) вирусы имеют эндогенное происхождение и являются отделившимися генами или другими клеточными структурами, ставшими автономными.
Согласно первой гипотезе, вирусы являются потомками первоначальных протобионтов, которые приспособились к паразитическому образу жизни в появившихся позже первобытных клеточных формах. Такой образ жизни мог продолжаться на протяжении длительных периодов, и современные вирусы представляют собой потомки многих первоначальных форм жизни. Дальнейшая эволюция их происходила по двум путям соответственно двум направлениям развития органического мира (прокариоты, эукариоты). Появление одноклеточных, а позже многоклеточных растений сопровождалось приспособлением древнейших, вирусов к внутриклеточному паразитированию в них, и отдаленными потомками их являются вирусы высших растений. Появление одноклеточных, а затем многоклеточных животных сопровождалось эволюцией поражавших их вирусов, потомками которых являются ныне существующие вирусы животных. Отдельная ветвь — вирусы прокариот (фаги).
На всех этапах эволюции органического мира был возможен обмен вирусами как между близкими, так и между далеко отстоящими таксономическими группами, включая обмен вирусами между растениями и животными. Этим объясняется существование групп сходных вирусов, поражающих филогенетически далеких хозяев, например реовирусы животных и вирусы раневых опухолей растений. Однако это гипотеза оставляет многое необъяснимым. Она не позволяет объяснить причины разнообразия генетического материала у вирусов.
Гипотезу эндогенного происхождения вирусов разделяют большинство вирусологов в связи с накоплением фактов об архитектуре и репродукции вирусов и гласит о том, что вирусы — отделившиеся компоненты клетки. Эта гипотеза допускает, что некоторые ДНК-содержащие вирусы вполне могли возникнуть из эписом ((от эпи... и греч. sóma - тело), генетические факторы, способные находиться в клетке либо в автономном (в цитоплазме) либо в интегрированном (включенными в хромосому) состоянии; представляют собой молекулы ДНК. К Э. относятся геном умеренного фага лямбда, некоторые R-факторы, сообщающие бактериям устойчивость к определённым лекарств. веществам, и некоторые др. Э. не являются обязательными компонентами клеток и могут переходить из одного состояния в другое, что зависит от вида клеток. Например, геном умеренного фага лямбда в клетках кишечной палочки может находиться в интегрированном либо в автономном состоянии, а в клетках возбудителя брюшного тифа - только в автономном состоянии. Находясь в автономном состоянии, большинство Э. ведут себя как типичные плазмиды. Ряд авторов видит в Э. переходное звено между структурами, определяющими хромосомную и нехромосомную наследственность) в результате приобретения генетической информации, необходимой для построения биологического чехла. Ряд ученых полагают, что некоторые вирусы могли возникнуть из таких клеточных органелл, как хлоропласты и митохондрии, которые, вероятно, сами произошли от бактерий. Мелкие вирусы, возможно, произошли из компонентов клеток позвоночных, в то время как герпес-, покс- и, вероятно, аденовирусы имеют иное происхождение. Эти крупные вирусы могли произойти из нуклеиновых кислот организмов, принадлежащих к другим типам, или в результате дегенерации микроорганизмов.
Разные группы вирусов неравномерно распределены в органическом мире. Вирусы поистине убиквитарны (повсеместны), и, вероятно, нет ни одного биологического вида, начиная с микоплазм и амеб и кончая цветковыми растениями и приматами, которые бы не были заражены вирусами.
Такая универсальная пораженность органического мира вирусами вряд ли может быть понятна, если их рассматривать только как паразитов — возбудителей болезней. Имеется много фактов, указывающих на пользу, приносимую вирусами своим хозяевам. Так, например, известно, что свойство вырабатывать токсины возбудителями дифтерии, столбняка и ботулизма не свойственно этим бактериям, а привносится поражающими их умеренными фагами, содержащими гены соответствующих токсинов. Устойчивость бактерий к антибиотикам также является результатом синтеза разрушающих или модифицирующих их ферментов, закодированных в плазмидах, которые могут передаваться от бактерии к бактерии. Таким образом, имеется много фактов, свидетельствующих о способности вирусов приносить полезную для хозяина информацию. Поражая разные виды, вирусы могут распространять эту информацию не только среди особей одного вида, но также между разными видами.
Имеются еще два крупных раздела вирусологических исследований, разработка которых начата недавно. Это, во-первых, определение места и роли вирусов в эволюции живого и, во-вторых, использование вирусов для генно-инженерных работ. Еще больше возрастает модельная роль вирусов для фундаментальных проблем биологии, особенно для ее центральной проблемы— определения сущности жизни. «...Вирусы дают нам единственный в своем роде ключ к пониманию функции нуклеиновой кислоты, а возможно, и к пониманию природы самой жизни». (У. Стенли, Э. Вэленс, 1964). Нет сомнения, что в будущем вирусы еще долго сохранят свою модельную роль для раскрытия сущности жизни, так как с них начинается на наших глазах огромный путь от молекул к организму (имеются в виду работы по генной инженерии и изучение связи между структурой и функцией).
Двойственность природы вирусов состоит в том, что их структура находится на молекулярно-генетическом уровне и поддается точным способам изучения, тогда как функции вирусов реализуются на организменном уровне, и исследование их в основном носит описательный характер.
Прионы
Помимо болезней, вызываемых РНК- и ДНК-содержащими вирусами, имеется необычная группа заболеваний центральной нервной системы — подострых спонгиозных трансмиссивных энцефалопатии (ПСТЭ) — скрепи (заболевание овец и коз), болезнь Крейтцфельда-Якоба; синдром Герстмана-Страусслера-Шейнкера; синдром "фатальной семейной бессонницы"; болезнь Куру; хроническую прогрессирующую энцефалопатию детского возраста или болезнь Альперса, болезнь Альцгеймера — распространенная форма старческого слабоумия. Все перечисленные заболевания отнесены к группе медленных инфекций. Они характеризуются длительным инкубационным периодом, который может продолжаться месяцы, годы, а то и десятки лет; в это время у зараженного человека или животного нет никаких симптомов. Когда же начинается собственно болезнь, она неуклонно прогрессирует и обычно приводит к гибели организма.
В 1966 г. Гайдушек, Г. Гиббс младший и М. Элперс сообщили о том, что возбудителем куру можно заразить обезьян, Через два года Гайдушек и Гиббс показали, что болезнь Крейтцфельда — Якоба, а также синдром Герстманна — Стрейсслера могут также передаваться обезьянам.
Сходство клинических и патологических признаков скрепи, куру, болезни Крейтцфельда — Якоба и синдрома Герстманна — Стрейсслера наводит на мысль о близком родстве этих болезней. Во-первых, начальные симптомы скрепи, куру и синдрома Герстманна — Стрейсслера — затруднения при ходьбе и потеря координации, свидетельствующие о нарушении деятельности мозжечка. Ни при одной из этих болезней не наблюдается ни воспалительного процесса, ни лихорадочного состояния, состав спинномозговой жидкости и число клеток в ней остаются нормальными. Это свидетельствует о том, что иммунная система не реагирует на возбудителей указанных болезней. Патологические изменения при этих болезнях происходят в пределах центральной нервной системы, и характерный признак — ненормальное размножение астроцитов (опорных клеток мозга). В нейронах уменьшается количество дендритных шипиков, важных для передачи нервных импульсов.
Наиболее распространенное из этих заболеваний — скрепи — было впервые описано в Англии еще в XVIII в. Болеют обычно овцы старше 4—4,5 лет. У больных животных сначала появляется расстройство координации движений и кожный зуд, заставляющий их непрерывно почесываться (отсюда и название: англ, to scrap — скрести). Затем наступают параличи, неизбежно заканчивающиеся через несколько месяцев гибелью животных.
В 1960 г. Р. Чэндлер добился успеха в заражении агентом скрепи мышей. В 1978 г. Б. Прузинер и др. обнаружили четкую корреляцию между концентрацией возбудителя и скоростью проявления болезни, а также временем смерти животного.
В отдельных деревнях папуасов племени форе, населяющего горные районы Новой Гвинеи, около 10% людей болели неизвестной болезнью, названной куру (на языке племени форе это слово обозначает «дрожать»). По симптомам эта болезнь очень напоминала скрепи у овец (те же нарушения координации движений и параличи), кроме того, отмечалось слабоумие. К. Гайдушеку, впервые описавшему в 1957 г. куру, и его сотрудникам удалось выяснить путь передачи болезни. Среди жителей этих районов был распространен обычай ритуального каннибализма: в знак уважения к умершему родственнику члены клана съедали некоторые его внутренние органы и натирали себе кожу его мозгом и печенью. Основными участниками ритуала были обитатели так называемых «женских хижин» — женщины и дети до 6 лет, чем и объяснялось преобладание женщин среди жертв куру. В основном благодаря усилиям К. Гайдушека ритуальный каннибализм был искоренен, и заболеваемость стала быстро сокращаться, причем сначала она исчезла у детей, потом у подростков и молодых людей. В настоящее время наблюдаются лишь единичные случаи заболевания куру среди лиц старше 30 лет. Очевидны два выхода: каннибализм — единственный путь распространения инфекции, инкубационный период заболевания может составлять до 30 лет.
И, наконец, так называемая болезнь Крейтцфельда — Якоба. Она распространена по всему земному шару, но встречается достаточно редко — несколько случаев на миллион населения. Примерно 20% заболеваемости составляет семейная форма; известны семьи, в которых было 12 больных в пяти поколениях. Обычно болезнь проявляется на 40—50-м году жизни и сопровождается опять же нарушениями координации движений, расстройством органов чувств и слабоумием. На поздних стадиях наступают параличи, которые через несколько месяцев (реже лет) приводят к гибели. Путь распространения этой болезни точно не известен.
Все заболевания группы ПСТЭ имеют не только сходную симптоматику, но и похожую патоморфологическую картину: деградацию мозговых нейронов, разрастание глиальных клеток и накопление так называемого мозгового амилоида. Образование аналогичных фибрилл при болезни Альцгеймера (старческом слабоумии) позволяет провести параллель между этим широко распространенным заболеванием (по некоторым оценкам, им болеют до 10% лиц старше 65 лет) и ПСТЭ. Распространенность болезни Альцгеймера, естественно, повышает интерес к этой группе болезней.
Хотя эти болезни и не входят в число важнейших медицинских проблем (главным образом потому, что встречаются сравнительно редко), их изучение уже почти 40 лет составляет одну из фундаментальных задач вирусологии, а природа их возбудителей — одну из самых интригующих загадок этой науки.
Чем же отличаются эти возбудители от других, обычных вирусов? Согласно современным представлениям, вирусы — это автономно воспроизводящиеся (реплицирующиеся) генетические системы, которые продуцируют информационную, или матричную, РНК (мРНК), но лишены собственной системы трансляции (синтеза белков) и поэтому используют трансляционный аппарат клетки-хозяина. В результате такого взаимодействия образуются все вирусные белки, в том числе так называемые структурные белки, в которые «одевается» носитель генетической информации — нуклеиновая кислота вируса, без чего она не может переходить из одной клетки в другую.
Длительное изучение возбудителей ПСТЭ показало, что они почти по всем этим признакам так или иначе отличаются от классических вирусов, что и отразилось в другом их названии — «неканонические вирусы». Результаты последних лет заставляют вполне серьезно обсуждать возможность полного отсутствия нуклеиновых кислот у этих агентов. А поскольку возбудители ПСТЭ обладают такими важными признаками любого живого организма, как наследственность и изменчивость, необходимо понять, как соотносится эта возможность с основными принципами биологии.
Скрепи удалось передать не только норкам, но морским свинкам, мышам и хомячкам. И во всех случаях инфекционный агент проходил через фильтры, задерживающие самые мелкие бактерии. Все четыре возбудителя (куру, энцефалопатии норок, скрепи и болезни Крейтцфельда — Якоба) близкородственны, возможно, это разные штаммы одного и того же «вируса».
Однако по мере изучения «вирусы» скрепи вызывали у исследователей все возрастающее недоумение. Дело в том, что вирусного в них было очень мало.
Кроме двух свойств — способности агента проходить через бактериальные фильтры и мутаций, приводящих к возникновению новых штаммов (что указывает на существование у возбудителя собственного генотипа), все остальные свойства агента были в высшей степени необычными.
Во-первых, в пораженных тканях ни в оптическом, ни в электронном микроскопе никогда не удавалось наблюдать каких-либо структур, похожих на частицы искомого вируса. Во-вторых, все попытки получить у животных антитела против возбудителя окончились неудачей. В-третьих, агент не мог размножаться ни на одной из многочисленных испытанных культур клеток. Но самой поразительной оказалась исключительная устойчивость этого возбудителя к разнообразным воздействиям, эффективно подавляющим инфекционность бактерий и вирусов: нагреванию, обработке формальдегидом, ультрафиолетовому облучению, ионизирующей радиации.
Фиксированные формалином образцы инфекционного мозга (первичные препараты для патогистологии) сохраняют инфекционность после часовой обработки в условиях сухого жара при 360°С. Инактивация агента скрепи ионизирующей радиацией и ультрафиолетом отличалась от инактивации вирусов не только количественно, но и качественно: его чувствительность к ионизирующей радиации резко повышалась в присутствии кислорода, в то время как обычные вирусы таким свойством не обладают. Выраженный «кислородный эффект» характерен для инактивации белковых или липидных систем; для инактивации нуклеиновых кислот присутствие кислорода несущественно. Исследование спектра действия инактивирующего ультрафиолета показало, что для агента скрепи наиболее эффективен ультрафиолет с длиной волны 235 нм, а не 254—260 нм, как для подавляющего большинства бактерий и вирусов (напомним, что длины волн 254—260 нм соответствуют максимуму поглощения нуклеиновых кислот). Результаты этих экспериментов заронили первые серьезные сомнения в том, что инфекционность агента скрепи связана с нуклеиновой кислотой.
Оказалось, что инфекционный агент скрепи весьма прочно связан с клеточными мембранами и не отделяется от них стандартными методами (обработка детергентами в обычных концентрациях). Исходя из этого была предложена так называемая мембранная гипотеза: агент скрепи не содержит нуклеиновой кислоты, а представляет собой самореплицирующийся фрагмент мембраны. Однако в силу, мягко говоря, неортодоксального характера этой гипотезы и отсутствия детальной биохимической характеристики агента мембранная гипотеза не была воспринята сколько-нибудь серьезно. Исследователи склонны были считать, что агент скрепи все же содержит нуклеиновую кислоту, но она либо имеет некую необычную структуру, либо каким-то образом защищена от инактивирующих воздействий.
В 1971 г. Т. Динер открыл вироиды — удивительные агенты, вызывающие ряд болезней растений. Эти сравнительно мелкие РНК с мол. массой около 100 тыс. Д, лишенные какой-либо оболочки, не кодируют никаких белков (таких размеров хватило бы для кодирования лишь коротких полипептидов) и, очевидно, реплицируются при участии ферментов растительной клетки.
Однако вскоре выяснилось, что воздействия, вполне эффективно инакти-вирующие вироиды, в частности ферменты, разрушающие РНК (рибонукле-азы), на агент скрепи не влияют. В печати появилось сообщение, что инфекционность этого агента будто бы ассоциирована с низкомолекулярной ДНК, но проверка в других лабораториях не подтвердила этих данных.
Таким образом, к началу 80-х годов природа возбудителей ПСТЭ оставалась по-прежнему таинственной; ясно было лишь, что они качественно отличаются от всех известных инфекционных агентов. Выходом из тупика могла быть только разработка эффективных методов очистки агентов ПСТЭ.
Решению этой задачи способствовало в первую очередь создание в 1971 г. группой исследователей под руководством Г. Чэндлера (Великобритания) относительно быстрого и простого метода титрования инфекционности агента скрепи на сирийских хомячках. У этих животных инкубационный период заболевания намного короче, чем у овец и даже мышей, причем его продолжительность обратно пропорциональна заражающей дозе. Теперь определить инфекционность одного образца можно всего лишь за 60—70 дней на четырех хомячках. Таким образом, эксперименты по очистке агента стали посильным делом. Как и следовало ожидать, это привело к быстрому прогрессу исследований.
Разработанные этой группой схемы очистки агента скрепи оказались неожиданно довольно простыми и включали сочетание стандартных методов ультрацентрифугирования и электрофореза; ключевыми этапами явились, по-видимому, освобождение инфекционного агента от мембран путем продолжительной обработки высокими концентрациями детергентов, а также обработка препаратов ферментами, расщепляющими нуклеиновые кислоты (нуклеазами) и белки (протеазами). В результате были получены препараты с достаточно высокой степенью очистки.
В освобожденных от мембран препаратах был обнаружен единственный белок с мол. массой около 30 тыс. Д или набор белков с очень близкими мол. массами. Когда в аналогичных условиях разделяли экстракты нормальных тканей, в соответствующих фракциях также находили белки с мол. массой около 30 тыс. Д. Разница между инфекционными и контрольными препаратами выявлялась при обработке протеазами: в условиях, когда все белки нормальной ткани полностью переваривались, 30 К белок оставался устойчивым. Этот белок расщеплялся лишь при гораздо более длительной протеазной обработке и (или) при более высоких концентрациях фермента. В электронном микроскопе фракции, содержащие инфекционный агент, выглядели как двойные фибриллы диаметром 4—6 и длиной 50—500 нм. Содержание фибрилл в препаратах коррелирует с титром инфекционного агента.
Оказалось, что агент скрепи ведет себя, как белок с мол. массой не менее 16 тыс. Д и не более 50 тыс. Д. Все приведенные данные указывают на то, что 30 К белок является существенным компонентом инфекционного агента. На этом основании С. Прузинер высказал предположение, что агент (ы) ПСТЭ относятся к совершенно новому классу патогенов, не имеющих в своем составе нуклеиновой кислоты, но содержащих необходимый для проявления инфекционности белок. Для обозначения объектов этого класса С. Прузинер предложил термин «прион» (по транслитерации начальных букв первых двух слов в словосочетании protein infections particle — белковая инфекционная частица, англ.). Протеин-прион (PrP) представляет собой сиалогликопротеид с молекулярной массой 33000-35000 дальтон, или 33-35 kD, кодируемый единственным геном, расположенным у человека в 20 хромосоме. Он состоит у человека приблизительно из 254 аминокислот, включая 22-членный N-терминальный сигнальный пептид. Прион PrP(с) найден у всех млекопитающих. Его жизненный полупериод составляет несколько часов, но он хорошо сохраняется в течение развития. К настоящему времени установлено 18 различных мутаций гена PrP человека, которые связаны с различными прионовыми болезнями.
Таким образом, методом исключения пришли к третьей гипотезе, согласно которой прион — это клеточный белок, не синтезируемый в организме (т. е. ген, кодирующий его, в норме не работает).
Прионный белок в пораженных организмах, конвертируется в другую изоформу принципиально отличную от первой по своей физхимии. Конверсия происходит в результате перестройки вторичной структуры молекулы нормального предшественника в непосредственном контакте с патологическим белком (собственно прионный белок) и, возможно, с еще одним белком - белком-помошником. При этом он практически теряет чувствительность к протеазам, сильно снижается его растворимость, приобретается способность к аутоагрегации с образованием амилоидных фибрилл в дальнейшем ведущем к образованию амилоидных бляшек и этот процесс происходит в нервной ткани.
Можно предположить, что и белок приона, встраиваясь в клеточные мембраны, запускает некий специфический каскад протеинкиназных реакций, в результате которых репрессор транскрипции гена приона фосфорилируется и инактивируется.
Следует отметить, что активация белком собственного гена достаточно хорошо известна: таким способом регулируется, например, работа некоторых генов бактериофага X (лямбда).
Предполагаемая гипотеза, по мнению Е. В. Кунина и К. М. Чумакова (1985), не противоречит тому, что известно сегодня о свойствах приона. Косвенным подтверждением существования гена приона в клетке служат данные о взаимодействии разных «штаммов» агента скрепи (различающихся по продолжительности инкубационного периода — единственному надежному генетическому признаку агента) с разными линиями животных. В результате таких исследований выявлены гены sip (у овец) и sine (у мышей), имеющие множественные аллели, обусловливающие различную длительность инкубационного периода для разных «штаммов» скрепи.
Еще меньше, чем о механизмах репродукции приона, можно сказать о его функциях в нормальной жизнедеятельности животных (если такие функции вообще имеются). Как уже отмечалось, у взрослых животных в норме ген приона, по-видимому, «молчит».
Таким образом, возбудители скрепи и болезни Крейтцфельда — Якоба — это инфекционные агенты, состоящие из крупных белковых молекул.
Виройды
Открытие их принадлежит Т. Динеру (1971). Вироиды, как и прионы, — это новые классы субвирусных возбудителей болезней. Они лишены оболочки, "представляют ковалентно замкнутые кольцевые молекулы РНК, состоящие из 246—371 нуклеотидов, не инкапсидированы, мол. масса РНК 120 кД. В клетках хозяина вироиды локализованы в ядрах; их можно выделить как свободные нуклеиновые кислоты вместе с другими РНК и белками.
В настоящее время кроме вироида веретеновидности клубней картофеля известно еще шесть вироидов, поражающих растения: вироиды экзокортиса цитрусовых, задержки роста хризантем, хлоротической крапчатости хризантем, болезни «каданг» кокосовой пыльцы, бледных плодов огурцов, вироид, карликовости хмеля, верхушки томатов, «планто мехо» томатов и карликовости лопуха (Сангер, 1984). Не исключено существование вироидов, поражающих животных и человека.
Геномы вироидов очень малы. Возбудитель веретеновидности клубней картофеля является одним из наиболее крупных. Он состоит из 359 нуклеотидов. Его молекула содержит многочисленные внутримолекулярные спаренные основания, которые организованы в чередующиеся последовательности спиральных участков и отделены друг от друга внутренними петлями.
Высказано предположение о том, что вироиды происходят из генетического материала хозяина и представляют пример аутоиндуцирующихся регу-ляторных молекул.
ПРОТИВОВИРУСНЫЙ ИММУНИТЕТ
Иммунология вирусных инфекций в последние годы достигла больших успехов. Советскими учеными созданы эффективные живые и инактивированные вакцины против ряда вирусных болезней животных. Открыты новые факторы и механизмы противовирусного иммунитета (ингибиторы, интерферон, клеточный иммунитет).
В понятие противовирусного иммунитета входят три категории защитных механизмов: 1) естественная видовая резистентность; 2) неспецифические клеточные и общефизиологические реакции (участие интерферона, неспецифических ингибиторов, физиологическая температура тела, пиноцитоз вирусных частиц, фагоцитоз зараженных вирусом клеток); 3) специфический приобретенный иммунитет после переболевания или иммунизации (образование его связано с участием В-лимфоцитов в продукции антител класса G, М, А и Е, а также с участием Т-лимфоцитов),