РБТЛ – РЕАКЦИЯ БЛАСТТРАНСФОРМАЦИИ ЛЕЙКОЦИТОВ.

РБТЛ используется для определения физиологической активности (пролиферативного потенциала) клеток на неспецифические активаторы (митогены) и специфические антигены. Принцип реакции - активация лимфоцитов под влиянием стимулов с последующей трансформацией их в бласты. В качестве активаторов чаще всего используют ФГА (фитогемагглютинин) и конканавалин А (Кон-А).

В пробирку с питательной средой №199 помещают исследуемые лимфоциты и добавляют ФГА. Инкубируют 72-96 часов при 37^оС. Пробирку без добавления ФГА используют как контроль. Пробирки центрифугируют. Из осадка готовят мазки, окрашивают по Романовскому- Гимзе.

Оценка результатов. В контрольной пробирке бластных клеток нет, а в опытной должно быть 60-80% бластных клеток. Сниженное количество бластов свидетельствует о снижении пролиферативной активности лимфоцитов.

Лимфоциты Трансформация в бласты

РТМЛ - РЕАКЦИЯ ТОРМОЖЕНИЯ МИГРАЦИИ ЛЕЙКОЦИТОВ

Принцип метода.

РТМЛ является одним из методов оценки функционального состояния Т- системы иммунитета. В основе реакции лежит способность Т-лимфоцитов выделять биологически активные субстанции – лимфокины, в том числе и факторы, ингибирующие миграцию лейкоцитов. Так, в нормальных условиях лейкоциты, помещенные в питательную среду при 37^оС, способны мигрировать, образуя через 18-24 часа так называемую зону миграции. Если в среду для культивирования добавить митоген (например, ФГА) или антиген, к которому сенсибилизирован организм, то лимфоциты, содержащиеся в культуре, активируются и начинают продуцировать фактор торможения миграции. При этом величина зоны миграции резко уменьшается. По степени торможения миграции лейкоцитов можно судить о лимфокинпродуцирующей способности иммунокомпетентных клеток, а, следовательно, об их функциональной активности. Есть несколько вариантов проведения реакции, один из них – капиллярный, для которого используют пятиканальные капилляры Трошанова.

Сравнивая зону миграции без митогена (контроль) с таковой в присутствии митогена (опыт), определяют индекс миграции (ИМ).

эритроциты+ лейкоциты

гранулоциты

	……
	…..
	…..
	…..
	……

опыт (гепаринизированная кровь пациента +питательная среда+ ФГА/ Аг)

контроль (гепаринизированная кровь +питательная среда)

	……………………………
	……………………………
	………………………………
	……………………………
	………………………………

Оценка результатов:

ИМ- индекс миграции лейкоцитов

ИМ = S опыт/S контроль. Норма (с ФГА) - 0,2-0,8.

В норме происходит выработка фактора торможения миграции лейкоцитов. Этот процесс может быть нарушен при ИД состоянии тогда индекс приближается к 1.

При проведении РТМЛ с антигенами (лекарства, аллергены, вакцины и т.д.) ИМ равный или менее 0,7 учитывается как положительный результат, свидетельствующий о сенсибилизации организма к данному антигену. У здорового человека в этом случае ИМ =1 (±0,2).

Оценка гуморального звена иммунитета

ОПРЕДЕЛЕНИЕ УРОВНЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ МЕТОДОМ РАДИАЛЬНОЙ ИММУНОДИФФУЗИИ

ПО МАНЧИНИ

Иммуноглобулины классов G, A и M определяются в сыворотке пациента (сывороточные иммуноглобулины) и в секретах (секреторные иммуноглобулины).По механизму это реакция преципитации в геле. Для её проведения необходимы агар и сыворотки, содержащие антитела к иммуноглобулинам человека. Ранее моноспецифические сыворотки к иммуноглобулинам человека получали при иммунизации ими кролика.

IgG человека кролик 1 Ат к IgG человека

IgA человека кролик 2 Ат к IgA человека

IgM человека кролик 3 Ат к IgM человека

В настоящее время такие антитела получают с помощью гибридом, то есть используют моноклональные антитела.

К расплавленному теплому агару добавляют сыворотку, содержащую Ат к IgG человека, заливают на стекло ровным слоем, дают застыть, делают лунки, заливают в лунки разведения контрольной сыворотки (с известным содержанием IgG) и исследуемые сыворотки:

Разведения контрольной сыворотки:

Цельная 1/2 1/4 1/8 1/16

1 2 3 4 5 1,2,3,4,5 –

сыворотки пациентов

После инкубации измеряют диаметр преципитации колец контрольной сыворотки, строят график (соотношение концентрации Ig и диаметров колец), затем измеряют диаметры исследуемых сывороток и по графику определяют концентрацию иммуноглобулинов в сыворотке больного.

Аналогично определяют и другие иммуноглобулины.

Метод высоко информативен в диагностике первичных и вторичных иммунодефицитных состояниях и хронических инфекциях. Иммуноглобулины снижаются при некоторых иммунодефицитных состояниях (когда нарушается выработка иммуноглобулинов), повышаются при миеломной болезни (злокачественное разрастание одного из клонов В-лимфоцитов и, как следствие, бесконтрольная продукция иммуноглобулинов).

IgM повышается - при перинтальных инфекциях (цитомегаловирусная, токсоплазмоз, краснуха, и др. вирусные инфекции); также повышается при острых септических состояниях, инфекционном мононуклеозе, микоплазменной пневмонии, вирусных гепатитах, циррозе, ревматоидном артрите, особенно в начальном, трудном для диагностики периоде артритов, при обострении СКВ. При некоторых заболеваниях повышение уровня Ig М свидетельствует о хроническом процессе.

IgM снижается - при первичных и вторичных ИД состояниях, при гастроэнтеропатиях, ожоговой болезни, иммунодепрессивной терапии.

IgGповышается - при разных заболеваниях, его повышение часто сопутствует активности процесса. Высокие концентрации данного иммуноглобулина наблюдаются при аутоиммунных процессах, острых инфекционных состояниях в фазу вторичного иммунного ответа. Увеличение концентрации моноклональных IgG имеет место при IgG-миеломе, бессимптомной моноклональной гаммапатии (редкие случаи).

IgG снижается - при первичных и вторичных ИД, при гастроэнтеритах с потерей белка, при нефротическом синдроме, при иммунодепрессивной терапии.

IgA повышается - при перинатальных инфекциях, хронических заболеваниях печени, подострых и хронических инфекциях, аутоиммунных заболеваниях, IgA - миеломе, бессимптомной гипергаммаглобулинемиии (редкие случаи).

IgA снижается - при ИД, ожоговой болезни, селективном дефиците IgA. Лица с дефицитом IgA предрасположены к хроническим воспалительным, аутоиммунным и аллергическим заболеваниям.

В настоящее время всё более широкое распространение получают более современные методы определения уровня иммуноглобулинов: ИФА, нефелометрический, турбодиметрический.

ЦИК ПО ХАШКОВОЙ

Метод основан на способности ПЭГ (полиэтиленгликоля) преципитировать иммунные комплексы (т.е. комплексы Аг/Ат). По концентрации белка в преципитате судят о количестве ЦИК.

Норма для взрослых: 24 - 84 ед.

ЦИК - это нормальное явление для организма и уровень его повышается при любых острых воспалительных заболеваниях на непродолжительное время.

Высокий уровень ЦИК является один из показателей воспаления и тканевого повреждения. Высокий уровень ЦИК, как правило, коррелирует с активностью патологического процесса при аутоиммунных заболеваниях.

Низкий уровень ЦИК наблюдается редко, и как правило, бывает у маленьких детей и больных с низким содержанием белка в плазме крови.

Оценка фагоцитарного звена