Разведение антигена физиологическим раствором
| Степень агглютинации | |||||
| ++++ | +++ | ++ | + | – | |
| Антиген, разведенный 1:2 | 0,25 | 0,5 | 0,75 | 1,0 | |
| Физ. р-р | 1,0 | 0,75 | 0,5 | 0,25 | |
| % просветления |
Стандарт мутности готовят каждый раз при постановке РА иставят в термостат одновременно с основной реакцией. Титром сыворотки является максимальное ее разведение, дающее 50% агглютинации, – просветление, оцениваемое на 2+. При применении стандартизированного диагностикума титры исследуемых сывороток соответствуют количеству международных единиц антител (МЕ/мл). Так, титры 1:50, 1:100, 1:200 и т.д. соответственно равны 50, 100, 200 и т.д. МЕ/мл.
При диагностической оценке РА рекомендуется следующая схема: титр сыворотки 1:100 (100 МЕ/мл) – результат положительный; титр сыворотки 1:200 (200 МЕ/мл) – результат положительный; титр сыворотки 1:400 (400 МЕ/мл) – результат резко положительный.
Диагностическим титром принято считать реакцию агглютинации не менее 2+ при разведении сыворотки 1:100 и выше (Приложение 6). [16]
2.4.3. Антиглобулиновая проба (реакция Кумбса)
В диагностике бруцеллеза, особенно при хроническом течении инфекции, когда реакция агглютинации может быть отрицательной или положительной в низких титрах, важное место следует отвести выявлению неполных антител. При постановке реакции Кумбса используют предварительно оттитрованную антиглобулиновую сыворотку против глобулинов человека (например – антиглобулиновая сыворотка для иммуноэлектрофореза против глобулинов человека).
Техника постановки реакции Кумбса (РК). В начале ставят реакцию агглютинации (Райта). После учета реакции агглютинации (через 20 часов) берут не менее трех пробирок первых разведений при отрицательном результате реакции агглютинации или не менее трех пробирок, начиная со слабоположительного результата (+, ++). Эти пробирки центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 20 минут для осаждения антигена. Надосадочную жидкость осторожно отсасывают пипеткой и отбрасывают, затем в каждую пробирку наливают по 1 мл физиологического раствора, тщательно встряхивают и снова центрифугируют, таким образом осадок промывают три раза.
После последнего центрифугирования к осадку отмытого антигена добавляют 0,5 мл антиглобулиновой сыворотки в рабочем титре пробирки тщательно встряхивают и помещают в термостат на 18-20 часов. Учет реакции проводят так же, как при реакции агглютинации. Диагностическим титром РК считается агглютинация не менее 2+ в разведении сыворотки 1:50.
Для контроля антиглобулиновой сыворотки необходимо взять в опыт сыворотку, содержащую неполные антитела с известным титром.
Контроль антигена. Взвесь антигена в физиологическом растворе подвергается отмыванию центрифугированием, как в основной реакции, после чего добавляют 0,5 мл антиглобулиновой сыворотки. При учете в контроле антигена наблюдается равномерное помутнение.
Схема титрования антиглобулиновой сыворотки для РК. Для титрования антиглобулиновой сыворотки (против глобулинов человека) необходимо иметь сыворотку крови человека, заведомо содержащую неполные антитела к бруцеллам в высоком титре.
Титрование антиглобулиновой сыворотки производят следующим образом. Вначале титруют положительную бруцеллезную сыворотку в реакции агглютинации (Райта). При этом делают несколько рядов разведений сыворотки, приблизительно – 8 рядов (табл.3).После учета реакции агглютинации во всех рядах отбирают пробирки, в которых отсутствует агглютинация (в табл. 3 – начиная с 1:400) и в каждой из них отмывают антиген согласно методике постановки реакции Кумбса.
Таблица3
Результаты реакции агглютинации
| N рядов | Разведения сыворотки, содержащей неполные антитела | |||||||
| 1:50 | 1:100 | 1:200 | 1:400 | 1:800 | 1:1600 | 1:3200 | 1:6400 | |
| 4+ | 4+ | 2+ | – | – | – | – | – | |
| 4+ | 4+ | 2+ | – | – | – | – | – | |
| 4+ | 4+ | 2+ | – | – | – | – | – | |
| 4+ | 4+ | 2+ | – | – | – | – | – | |
| 4+ | 4+ | 2+ | – | – | – | – | – | |
| 4+ | 4+ | 2+ | – | – | – | – | – | |
| 4+ | 4+ | 2+ | – | – | – | – | – | |
| 4+ | 4+ | 2+ | – | – | – | – | – |
Затем (табл. 4) делают несколько разведений титруемой антиглобулиновой сыворотки (в нашем примере от 1:10 до 1:250) и добавляют по 0,5 мл каждого разведения этой сыворотки в один ряд пробирок с оставшимся после отмывания антигеном.
Таблица 4
Результаты реакции Кумбса
| N рядов | Разведение антиглобулиновой сыворотки | Разведения сыворотки, содержащей неполные антитела | ||||
| 1:400 | 1:800 | 1:1600 | 1:3200 | 1:6400 | ||
| 1:10 | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | – | |
| 1:20 | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | – | |
| 1:40 | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | – | |
| 1:80 | 4+ | 4+ | 3+ | 2+ | – | |
| 1:100 | 4+ | 3+ | 2+ | – | – | |
| 1:150 | 4+ | 3+ | – | – | – | |
| 1:200 | 3+ | 2+ | – | – | – | |
| 1:250 | – | – | – | – | – |
Объем жидкости в каждой пробирке должен быть доведен до 0,5 мл. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при 370С. Результаты учитывают так же, как реакцию агглютинации. За титр антиглобулиновой сыворотки принимают ее наибольшее разведение (в нашем примере 1:80 – 4 ряд), которое выявляет неполные антитела в максимальном титре (1:3200). Для реакции Кумбса антиглобулиновая сыворотка применяется в удвоенном титре (1:40). [14]