Компоненты, используемые в ИФА.

Ферменты.Субстраты.Антигены и антитела.Образование конъюгата

.Пример.ПрямойИммуноферментный метод

1. В лунках панелей адсорбируют антигены или антитела (исследуемый материал). Выше отмечалось, что антигены существенно различаются по способности адсорбироваться на разных видах пластика в зависимости от того, к какому классу веществ (белкам, углеводам или липопротеинам) они принадлежат. Часто в прямом ИФА антиген, иммобилизованный на твердой фазе, это клетки и другие корпускулярные антигены.

Контроль. В качестве контроля используют лунки с адсорбированным положительным контрольным образцом, в котором обязательно содержится искомый антиген, и отрицательным контрольным образцом заведомо не содержащим исследуемого антигена. При наличии очищенного стандартного антигена реакцию проводят в нескольких разведениях, так чтобы можно было построить калибровочную кривую.

2. «Блокируют свободные места связывания, оставшиеся на твердой фазе, с помощью БСА казеина и др. (для предотвращения неспецифической сорбции конъюгата на твердой фазе).

3. В лунки вносят меченные ферментом антитела или антигены (конъюгат), инкубируют. Связывание конъюгата с твердой фазой будет происходить лишь в случае комплементарности обоих компонентов системы. После инкубации с коньюгатом лунки отмывают, удаляя, таким образом, не связавшуюся часть конъюгата.

4. Затем в лунки вносят субстрат, специфичный для используемого фермента, и инкубируют. По достижении оптимального уровня окрашивания в лунках с положительным контролем, ферментативную реакцию останавливают.

5. Учет реакции. Сначала результаты реакции учитывают визуально. Для более точного учета результатов интенсивность окрашивания оценивают на ИФА-ридере с соответствующим светофильтром. По результатам проведенного анализа строят график зависимости оптической плотносги от концетрации.

12.Энзимология – это раздел биохимии, изучающий ферменты и катализируемые ими реакции.

Медицинская энзимология – это энзимология, которая изучает применение ферментов в медицине. Основной задачей энзимологии является описание ферментов и связанных с ними процессов. Предметом изучения энзимологии являются ферменты. Эта наука занимается описанием их свойств и структуры, а также анализом механизма катализа.

В медицинской энзимологии выделяют три основных направления: энзимопатология; энзимодиагностика; энзимотерапия.

Энзимопатология – это наука, которая изучает энзимопатии.

Энзимопатии – это группа заболеваний, которые вызваны различными дефектами ферментов. Энзимопатий делятся на: наследственные (первичные) и приобретенные (вторичные).

Энзимодиагностика – методы диагностики болезней, патологических состояний и процессов, основанные на определении активности ферментов в биологических жидкостях.

Энзимотерапия – применение ферментов животного, бактериального или растительного происхождения и регуляторов активности ферментов с лечебной целью.

13.Энзимодиагностика– методы диагностики болезней, патологических состояний и процессов, основанные на определении активности ферментов в биологических жидкостях.

Направления энзимодиагностики:

1) Определение активности органо-, органеллоспецифических ферментов и их изоферментов.Определение в биологических жидкостях активности ферментов и их изоферментов позволяет установить локализацию патологического процесса, его стадию, выраженность, а также эффективность его лечения.

Ферменты плазмы крови по происхождению можно разделить на 3 группы:

1) секреторные ферменты - секретируются определенными органами в плазму крови, где и выполняют свою функцию. Например: ЛПЛ, ЛХАТ, ферменты свертывающей и противосвертывающей системы крови;

2) экскреторные ферменты - синтезируются в железах ЖКТ, выделяются в просвет ЖКТ, где обеспечивают процесс пищеварения. В кровь эти ферменты попадают при повреждении желез. Например, при панкреатите в крови обнаруживается панкреатическая липаза, амилаза, трипсин и т.д., при воспалении слюнных желез - амилаза слюны.

3) клеточные ферменты -функционируют только внутри клеток, в плазму крови они попадают во время повреждения (под действием медиаторов воспаления и т.д.) и гибели клеток (при некрозе). К ним относятся общие, органо- и органеллоспецифические ферменты.

За счет естественной гибели клеток клеточные ферменты имеют в плазме крови постоянно низкую активность. При поражении органа происходит значительный выход ферментов из его клеток и многократное увеличение активности этих ферментов в плазме крови.

Например: Аминотрансферазы. Локализуются в митохондриях, обеспечивают взаимопревращения аминокислот и кетокислот: АК1 + КК2 ↔ КК1 + АК2.

АСТ: асп+α-КГ↔ЩУК+глу. АСТ много в миокарде, по убыванию меньше в печени, скелетной мускулатуре, ЦНС, почках, семенниках. Активность в сыворотке крови 6-25МЕ/л.

АЛТ: ала+α-КГ↔ПВК+глу. АЛТ много в печени, поджелудочной железе, миокарде, скелетной мускулатуре. Активность в сыворотке крови 6-26МЕ/л.

Активность обеих трансаминаз в сыворотке крови возрастает в десятки раз при инфаркте миокарда (АСТ>АЛТ), при остром инфекционном гепатите (АЛТ>АСТ), а также при циррозе печени и мышечной дистрофии.

Информативными пробами являются креатинфосфокиназный и лактатдегидрогеназный тесты, относящиеся к некротическим ферментным методам. Их диагностическая ценность повысилась после внедрения в клиническую практику методов определения их изоферментов.

ЛДГ. Локализуется в цитозоле, обеспечивает взаимопревращения ПВК и лактата.

ЛДГ: ПВК+ НАДН2 ↔ лактат + НАД+. ЛДГ1 и ЛДГ2 наиболее активны в сердечной мышце и почках, ЛДГ4 ЛДГ5 - в скелетных мышцах и печени. Активность в сыворотке крови 55-140МЕ/л.

При инфаркте миокарда в сыворотке крови резко повышается активность ЛДГ1 и ЛДГ2, а при поражениях скелетной мускулатуры и печени (гепатит, отравления хлорорганическими соединениями) повышается активность ЛДГ4 ЛДГ5.

Креатинкиназа (КК). Локализуется в цитозоле, митохондриях, миофибриллах.

КК: Креатин + АТФ ↔ креатинфосфат + АДФ. Изофермент КК-ВВ находиться преимущественно в головном мозге, МВ – в миокарде, ММ – в скелетных мышцах. Активность в сыворотке крови КК в норме до 90МЕ/л.

В сыворотке крови КК-ММ повышается при повреждении скелетных мышц (при прогрессирующей мышечной дистрофии в 50 раз), КК-МВ - при инфаркте миокарда. КК-ВВ не проходит гематоэнцефалический барьер и не имеет значения для диагностики патологий ЦНС.

В сыворотке крови повышена активность амилазы при остром панкреатите, кисте поджелудочной железы; γ-глутамилтранспептидазы - при остром инфекционном или токсическом гепатите, хроническом гепатите, циррозе печени; кислой фосфатазы - при карциноме простаты; щелочной фосфатазы - при заболеваниях костей, закупорке желчных протоков, при беременности и у детей.

Определение активности ферментов с диагностической целью проводят также в моче, слюне, ликворе и биоптатах органов и тканей.

2) Определение активности ферментов и их констант (Km, t, pH).Это направление используют для диагностики наследственных патологий и выявления механизмов патогенеза ряда заболеваний.

3) Определение концентрации органических веществ с помощью ферментов. Использование ферментов в качестве реактивов позволяет определять концентрацию органических веществ с высокой точностью, так как ферменты обладают высокой чувствительностью и избирательностью к своим субстратам.

Наиболее интенсивно вопросы энзимодиагностики разрабатываются при заболеваниях печени, сердца, поджелудочной железы, злокачественных новообразованиях.

14. лабораторно-диагностические панели, определения понятия, структуры, параметры.

Диагностические панели (профили) - это комплексные лабораторные исследования, разработанные группой на основе клинического опыта и современных научных достижений. Профиль представляет собой комплексную программу лабораторного обследования, позволяющую осуществить диагностику функционального состояния органов, систем организма; определить риск возникновения патологий, выявить инфекции и оценить общее состояние организма.

Класс-я:

1) Минимальная

2) Максимальная

15) понятие о референтных величинах в лабораторной диагностике, значение в медицине

Референтные величины дают представление о диапазоне, в котором располагаются нормальныевеличины. Референтные величины в настоящее время установлены для ограниченного количества показателей (приблизительно 150). Установление референтных интервалов колебаний для каждого лабораторного параметра имеет существенное значение для всей проблемы надёжности лабораторной информации, так как сравнение с ними служит основанием для принятия диагностических и лечебных решений.

При оценке результатов лабораторных исследований необходимо помнить, что референтные величины являются статистическими данными 95% популяции, и отклонения за пределы диапазона не обязательно указывают на наличие патологии.

приблизительно у 5% здоровых людей выявляют «ненормальные» лабораторные показатели, поэтому не все значения, выходящие за пределы нормы, следует расценивать как патологические. И напротив, не всегда показатель, лежащий в интервале M+2SD, следует считать нормальным, так как диапазон многих параметров достаточно широк. Например, в норме гематокрит (Ht) у мужчин варьирует от 42 до 52%. Массивная кровопотеря может привести к падению Ht от 52 до 42%. Показатель 42% не вызовет тревоги у врачей, поскольку он относится к диапазону нормальных величин, хотя для конкретного пациента такое снижение может быть опасным для здоровья.

16) особенности белкового обмена у детей

При смешанном питании организм получает весь необходимый для синтеза белка набор аминокислот. Особенно важно поступление всех незаменимых аминокислот для растущего организма. Например, отсутствие в пище лизина приводит к задержке роста ребенка, вали-на — к расстройству равновесия у детей. Детям необходимо больше белка, чем взрослым, так как у них интенсивнее идут процессы роста и формирования новых клеток и тканей. Суточная потребность в бел-ке на 1 кг массы у новорожденного составляет 4-5 г, у ребенка до 10 лет — 3 г, до 12 лет — 2 г, у взрослых — 1,5— 1,8 г. Белковое голодание ребенка приводит к задержке, а затем и к полному прекращению роста и физического развития. Ребенок становится вялым, наблюдаются рез-кое похудение, распространенные отеки, поносы, воспаление кожных покровов, снижение сопротивляемости инфекциям. Серьезные нарушения развития у детей и подростков возникают потому, что белок является основным пластическим материалом организма, из которого образуются раз-личные клеточные структуры. Кроме того, белки входят в состав фер-ментов, гормонов, образуют гемоглобин и антитела крови. Конечными продуктами обмена белков являются азотсодержащие вещества — мочевина и мочевая кислота, из которых вначале образу-ется глюкоза, а затем — углекислый газ и вода.

Наши рекомендации