И последующей инкубации в аутологичной плазме крови
Ивонин А.Г.1,2, Пименов Е.В.1,2, Оборин В.А.3, Чернядьев А.В.3
1Отдел сравнительной кардиологии Коми НЦ УрО РАН, г. Сыктывкар, Республика Коми, Россия
2ФГБОУ ВО Вятская ГСХА, г. Киров, Россия
3ФГБОУ ВО ВятГУ, г. Киров, Россия
При традиционных способах введения антибиотиков наблюдаются такие побочные явления, как токсические и аллергические реакции, угнетение иммунитета, снижение общей реактивности организма [6]. Одним из способов решения данной проблемы является создание новой лекарственной формы антибиотиков путем заключения препаратов в аутологичные эритроциты. Использование эритроцитов в качестве переносчиков антибиотиков позволит снизить пиковую концентрацию препаратов в плазме крови в момент введения, увеличить время циркуляции лекарственных средств в кровотоке (за счет медленного высвобождения из клеточных «контейнеров»), минимизировать нежелательные реакции организма на медикаментозное воздействие [2, 10]. Сегодня имеются успешные примеры применения эритроцитарных носителей антибиотиков в медицине [8], однако в ветеринарной практике данное направление исследований остается без должного внимания.
Ранее нами была предложена методика экстракорпорального («вне тела») насыщения эритроцитов мелких домашних животных антибиотиками класса цефалоспоринов [7].
Цель работы – оценка морфологических свойств эритроцитов собаки при включении цефалоспоринового препарата, а также в условиях, моделирующих пребывание клеток, «нагруженных» антибиотиком, в кровеносном русле.
Материалы и методы.
Объектом исследования являлись эритроциты стабилизированной гепарином (5,0 ЕД/мл) венозной крови клинически здоровых собак (n=10) массой 12-18 кг. Эритроциты отделяли от плазмы и других форменных элементов крови центрифугированием (1000 g, 10 мин, 4°С) и дважды отмывали фосфатно-солевым буфером (рН 7,4).
Для включения в клетки использовали цефалоспориновый антибиотик III поколения цефтриаксон (ЦТР) («Биосинтез», Россия). Насыщение эритроцитов ЦТР осуществляли путем совместной инкубации клеток с препаратом в буферном растворе при 37°С [7]. Длительность инкубации составляла 20 мин, гематокрит суспензии – 80%, концентрация антибиотика – 20 мг/мл. В качестве «корректора» связывания ЦТР с эритроцитами применяли апротонный растворитель диметилсульфоксид (ДМСО) в концентрации 1,0 мг/мл среды [8]. Количество цефалоспорина в клетках после инкубации проб определяли микробиологическим методом [1].
Для моделирования поведения «нагруженных» антибиотиком эритроцитов в кровотоке клетки отделяли от несвязанного препарата путем центрифугирования и инкубировали в аутологичной плазме крови (гематокрит 40%) при 37°С в течение 30 минут.
Морфологию и поверхностную архитектонику эритроцитов изучали при помощи световой и сканирующей электронной микроскопии. Для этого клетки фиксировали в 2,5% забуференном растворе глутаральдегида в течение 1 часа при комнатной температуре, дважды промывали буфером и дважды – дистиллированной водой (1000 g, 5 мин, 4°С). При использовании метода световой микроскопии каплю взвеси фиксированных эритроцитов переносили на предметное стекло, накрывали покровным и исследовали под микроскопом «Миктрон-400М» («Ломо», Россия). Для проведения сканирующей электронной микроскопии взвесь клеток наносили тонким слоем на покровное стекло, высушивали на воздухе и напыляли слоем платины толщиной 6-7 нм. Препараты просматривали с использованием микроскопа JSM-6510 LV («Jeol», Япония) при ускоряющем напряжении 15 кВ.
Количественное распределение морфологических форм эритроцитов в препаратах оценивали по методике [3]. Цифровые значения представлены в виде среднего значения ± среднеквадратичное отклонение. Статистическую значимость различий между сравниваемыми группами определяли по непараметрическому критерию Манна-Уитни для независимых выборок, для зависимых выборок – по критерию Вилкоксона.
Результаты и обсуждение.
В предварительных экспериментах установлена зависимость эффективности насыщения эритроцитов ЦТР от наличия в инкубационной среде ДМСО. При отсутствии апротонного растворителя в клетки включалось 40,9±5,2% антибиотика. Внесение в пробы ДМСО приводило к повышению (Р<0,01) уровня включения ЦТР в эритроциты до 65,5±5,4%. Ввиду наличия у молекул цефалоспоринов ионогенных групп [9] вероятным механизмом связывания ЦТР с эритроцитами является фиксация на клеточной мембране. Также не исключено проникновение диссоциирующих на ионы молекул ЦТР внутрь клеток через белковые каналы мембраны. Повышение степени насыщения эритроцитов антибиотиком в присутствии ДМСО связывали с описанной в литературе [12] способностью последнего погружаться в липидную фазу биологических мембран, изменяя ее стабильность и проницаемость для других соединений.
Микроскопические исследования показали, что насыщение эритроцитов ЦТР сопровождалось выраженными изменениями морфологии и поверхностной архитектоники клеток (таблица 1). При обработке эритроцитов ЦТР по сравнению с контролем (клетками, инкубируемыми в аналогичных условиях в фосфатном буфере) значительно сокращалась доля дискоцитов (Р<0,01), снижалось количество плоских клеток, сфероцитов и стоматоцитов (чашеобразных клеток) (Р<0,05), но увеличивалось содержание эхиноцитов I порядка (дисков с одним или несколькими выростами), II порядка (дисков с грубыми конусовидными выростами по всей поверхности) и III порядка (сферических клеток с тонкими отростками в виде шипов) (Р<0,01). При инкубации эритроцитов с ЦТР в присутствии ДМСО по сравнению с обработкой одним антибиотиком в пробах снижалось содержание эхиноцитов I и II порядков (Р<0,01), но увеличивалось количество эхиноцитов III порядка (Р<0,01). Электронные микрофотографии морфологических форм эритроцитов в контроле и после обработки ЦТР приведены на рисунке 1а и б. Часть материалов по оценке поверхностной архитектоники клеток при насыщении антибиотиком опубликована ранее [5].
Изменения морфологических параметров эритроцитов после обработки ЦТР могли быть обусловлены характером взаимодействия антибиотика с мембранными структурами. Согласно гипотезе [11] к появлению кренированных (с наружными выростами) эритроцитов приводит встраивание экзогенных соединений во внешний монослой клеточной мембраны. Таким образом, наблюдаемая эхиноцитарная трансформация эритроцитов, возможно, объяснялась накоплением молекул ЦТР преимущественно в наружном слое мембраны и его непропорциональным расширением. Форма эритроцитов при обработке ЦТР без ДМСО, по-видимому, была также связана с высоким значением осмолярности среды, содержащей слабо проникающий в клетки антибиотик. Увеличение содержания эхиноцитов III порядка в пробах с ЦТР и ДМСО могло быть вызвано повышением проницаемости клеточной мембраны для антибиотика, индуцированного молекулами ДМСО. В этом случае поступление ЦТР внутрь эритроцитов приводило к увеличению объема внутриклеточной жидкости и вызывало разбухание клеток (образование эхиноцитов III порядка).
Таблица 1 - Морфологический состав эритроцитов собаки при различных вариантах экстракорпоральной обработки ЦТР и последующей инкубации в аутоплазме, %
| Формы эритроцитов | Вариант эксперимента | ||||
| контроль (инкубация в буфере) | обработка ЦТР | обработка ЦТР и ДМСО | обработка ЦТР + инкубация в аутоплазме | обработка ЦРТ и ДМСО + инкубация в аутоплазме | |
| Дискоциты (нормоциты) | 81,9±3,2 | 0,4±0,2** | 0,3±0,1** | 38,2±8,4**## | 34,8±9,7**## |
| Плоские | 6,3±1,0 | 4,3±1,2* | 3,8±0,8** | 9,8±1,6*## | 8,7±1,4*## |
| Эхиноциты: I порядка II порядка III порядка | 4,6±0,9 3,7±1,1 0,9±0,5 | 14,6±2,4** 74,4±4,9** 5,2±1,9** | 7,9±1,8**°° 40,8±7,2**°° 46,1±6,6**°° | 25,8±4,2**## 23,9±7,0**## 1,2±0,3## | 23,5±7,4**## 27,4±4,1**## 4,3±2,5**## |
| Сфероциты | 1,4±0,4 | 0,7±0,3* | 0,9±0,4* | 0,6±0,2* | 0,7±0,4* |
| Стоматоциты | 1,2±0,8 | 0,4±0,2* | 0,2±0,1** | 0,5±0,3* | 0,6±0,3* |
Примечание: *Р<0,05, **Р<0,01 – различия статистически значимы по сравнению с контролем; °°Р<0,01 – по сравнению с обработкой ЦТР без ДМСО; ##Р<0,01 – по сравнению с «нагруженными» ЦТР клетками до инкубации в аутоплазме.
| а |
| в |
| г |
| б |
Рисунок 1 - Электронные микрофотографии эритроцитов собаки: а – контроль; б – после обработки ЦТР; в – после обработки ЦТР с ДМСО; г – после обработки ЦТР с ДМСО и инкубации в аутологичной плазме. Увеличение ×2000-2500.
Инкубирование «нагруженных» ЦТР клеток в аутологичной плазме крови значительным образом сказывалось на морфологии клеток (табл. 1, рис. 1г). После обработки плазмой в пробах увеличивалось содержание дискоцитов, плоских клеток и эхиноцитов I порядка (Р<0,01), снижалось количество эхиноцитов II и III порядков (Р<0,01). Полученные результаты согласовывались с данными об обратимом характере превращения «дискоцит-эхиноцит» [4]. Повышение числа нормоцитов и снижение степени эхиноцитарной трансформации клеток в экспериментах связывали как с помещением эритроцитов в физиологическую среду, так и выходом из них части ЦТР (параллельно нами показано, что инкубация в плазме приводит к выделению из эритроцитов во внеклеточную среду порядка 30-36% связанного ранее антибиотика). Можно предположить, что при реинфузии модифицированных ЦТР эритроцитов в кровеносное русло также будет происходить их обратная трансформация в нормальную дискоидную форму, необходимую для прохождения через узкие капилляры. Это, в свою очередь, может свидетельствовать об отсутствии выраженного отрицательного влияния эритроцитов-носителей на процессы тканевой микроциркуляции.
Выводы
Обработка эритроцитов собаки цефалоспориновым антибиотиком в условиях in vitro приводит к структурным изменениям мембраны, выражающимся в трансформации клеток по эхиноцитарному пути. Внесение в среду инкубации ДМСО с целью стимуляции накопления антибиотика в клетках усиливает морфологические изменения эритроцитов. Инкубация «нагруженных» цефалоспорином клеток в аутологичной плазме крови способствует приобретению ими исходной морфологической формы (дискоцитов). Полученные результаты расширяют представления о характере взаимодействия цефалоспоринов с эритроцитарной мембраной в условиях экстракорпоральной обработки клеток, позволяют прогнозировать поведение эритроцитов-переносчиков в кровотоке.
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке гранта РФФИ 15-04-06312.
Литература
1. Антибиотики, сульфаниламиды и нитрофураны в ветеринарии. Справочник / В.Ф. Ковалев, И.Б. Волков, Б.В. Виолин и др. – М.: Агропромиздат, 1988. – 223 с.
2. Генинг, Т.П.Использование форменных элементов крови для направленной доставки химиотерапевтических и диагностических препаратов в очаг поражения / Т.П. Генинг, И.И. Колкер, Ж.Ш. Жумадилов// Антибиотики и химиотерапия. – 1988. Т. 33, № 11. – С. 867–871.
3. Козинец, Г.И. Поверхностная архитектоника клеток периферической крови в норме и при заболеваниях системы крови / Г.И. Козинец, Ю.А. Симоварт. – Таллин: Валгус, 1984. – 116 с.
4. Кузник, Б.И. Клеточные и молекулярные механизмы регуляции системы гемостаза в норме и при патологии: Монография / Б.И. Кузник. - Чита: Экспресс-издательство, 2010. - 832 с.
5. Морфофункциональные характеристики эритроцитов собаки при экстракорпоральном насыщении цефалоспориновыми антибиотиками / А.Г. Ивонин, Е.В. Пименов, В.А. Оборин, А.В. Чернядьев // Известия Коми НЦ УрО РАН. – 2016. - №4 (28). - С.24–30.
6. Никитин, А.В. Антибиотики и макроорганизм / А.В. Никитин // Антибиотики и химиотерапия. – 1999. – Т. 44, № 12. – С. 31–36.
7. Оценка возможности включения цефалоспориновых антибиотиков в эритроциты мелких домашних животных / А.Г. Ивонин, Е.В. Пименов, С.Н. Копылов, В.А. Оборин // Вестник ветеринарии. – 2015. – № 73 (2). – С. 64-68.
8. Фармакоэкономический анализ применения клеточно-ассоциированной антибактериальной терапии при внебольничной пневмонии различной степени тяжести / Н.А. Пятаев, В.В. Кузин, Г.А. Бояринов и др. // Вестник интенсивной терапии. – 2006. – № 5. – С. 14-17.
9. Чуев, П.Н. Клиническая фармакология цефалоспоринов / П.Н. Чуев, В.И. Кресюн, О.Ю. Каташинский. – Одесса: Черноморье, 1997. – 136 с.
10. Effective drug targeting by erythrocytes as carrier systems / V.S. Gopal, A.N. Ranjith Kumar, N.A. Usha et al. // Curr. Trends Biotechnol. Pharm. – 2007. –Vol. 1, №1. – Р. 18-33.
11. Sheets, M.P. Biological membranes as bilayer couples. A molecular mechanism of drug-erythrocyte interactions / M.P. Sheets, S.J. Singer // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1974. – Vol. 71, № 11. – P. 4457-4461.
12. Yu, Z.W. The modulation of membrane structure and stability by dimethyl sulphoxide (review) / Z.W. Yu, P.J. Quinn // Mol. Membr. Biol. – 1998. – Vol. 15, № 2. – Р. 59-68.
УДК 616.619