Современные лабораторные методы оценки углеводного обмена.

Глюкоза – основной представитель углеводов плазмы, альдогексоза.

В крови в небольших количествах обнаруживается фруктоза (концентрация её колеблется в широких пределах: от 2,77 до 27,75); пентозы: рибоза и дезоксирибоза (20-30 мг/л), гликоген (100-150 мг/л), основное кол-во кот-го содержится в форм. эл. крови, также следы галактозы, мальтозы, лактозы, сахарозы, маннозы. К их исследованию прибегают значительно реже. Известную диагностическую ценность представляет определение продуктов их метаболизма – молочной и пировиноградной кислоты, также акт-сть ферментов углев. обмена. М-ды определения сод-ия глюкозы в крови:

1. редуктометрические м-ды. Осн-ны на св-ве Glu восстанавливать соли тяжелых металлов в щелочной среде. 2. Колориметрические. Базируются на методологии определения в конечной точке. Делятся на: неферментативные и ферментативные (ручные). 3. Неферментативные м. состоят в образовании окрашенных соединений благодаря способности Glu восстан-ть нек. хим. в-ва и их свойству давать с определенными реактивами цветные комплексы, поглощ. свет в видимой области спектра. Напр. восст. двухвал. ионов меди в одновал.; применение ортотолуидина, анилина, антрона с последующей фотометрией. 4. энзимные методы. Основываются на глюкозооксидазной и гексокиназной реакциях. Ферментативные глюкозооксидазно-пероксидазные методы с колориметрическим завершением являются более специфичными, чем аналог неферментативные. Экспресс-опр-ие с использованием методологии «сухой» химии. 5. Масс-фрагментографии. Суть: смешивается проба с обр., сод-м меченную дейтерием глюкозу, затем разрушение на специф фрагменты; по соотн. фрагментов меч. и немеч. глюкозы оцен-ся конц-ия глюкозы в крови. Для полуколи-ой, скрининговой оценки исп-ся тест-полоски.

3(89). Лабораторные методы в диагностике аутоиммунных заболеваний. Определение ревматоидного фактора, антинуклеарных антител, антител к ДНК, антифосфолипидных антител. Аналитическая процедура. Диагностическая значимость:Аутоиммунитет – способность распознавать Ag-ые детерминанты собственных тканей. АИЗ – клинические синдромы, при которых повреждение ткани появляется в результате ошибочного ответа ИС по отношения к собственным нормальным Ag. Антигены, против которых развивается аутоиммунный ответ, называют аутоантигенами. Центральный механизм заболеавний – дефект иммунологической толерантности, приводящий к активации и экспансии собственных Agспецифических Т- и В-клонов, продуцирующих аутоAt, огромные количества цитокинов и других воспалительных медиаторов. Нарушение регуляции физиологических аутоиммунных процессов приводит к развитию клеточных и гуморальных иммунных реакций против компонентов собственных тканей, в результате – структурные и /или функциональные нарушения в органах-мишенях.

Важная черта АИЗ: гиперпродукция аутоAt, клинико-диагностическое значение имеет специфичность аутоAt. аутоAt направлены против аутоAg (нормальных компонентов клеток и тканей). аутоAg м. локализоваться внутриклеточно (компоненты ядра и цитоплазмы), на клеточной поверхности (молекулы адгезии, гормональные рецепторы, нейротрансмиторы), экстрацеллюлярно (в составе комплексов – циркулирующиегомоны, ЛПНП, фосфолипиды и др.).

Золотым стандартом для определении АФЛ с-ма является определение АТ к кардиолипину, фосфотидилсерину, фосфотидилэтаноламину. Одновременное наличие АТ к этим фосфолипидам явл высокочувствительным и специфическим тестом для диагностики АФЛ с-ма.)

1. Волчаночный антикоагулянт. (ВА) относится к иммуноглобулинам класса IgG и представляет собой гетерогенную группу антител против отрицательно заряженных фосфолипидов. Уровень волчаночного антикоагулянта в плазме в норме – 0,8–1,2 усл. ед. Наличие ВА у больных можно заподозрить при необъяснимом удлинении АЧТВ, коагуляционных тестов со змеиным ядом, времени рекальцификации и в меньшей степени протромбинового времени при всех других нормальных показателях коагулограммы. ВА обычно обнаруживают по удлинению у больных АЧТВ, при этом они не имеют выраженных проявлений кровоточивости, в то же время у 30 % из них может развиваться тромбоз, т.е. имеется парадоксальная реакция – удлинение АЧТВ и развитие тромбоза. Механизм возникновения тромбоза у больных с ВА точно не установлен

2. Антитела к кардиолипину – это антитела к фосфолипидам (кардиолипину – дифосфатидилглицеролу) клеточных мембран, ведущий показатель наличия антифосфолипидного синдрома у больных. Антитела к кардиолипину являются основной фракцией антител к фосфолипидам. Определенный уровень аутоантител к кардиолипину присутствует в крови и здоровых людей, но при повышении их уровня возникает качественно новое состояние в системе гемостаза. Эти антитела взаимодействуют с фосфолипидами мембран тромбоцитов и эндотелиальных клеток сосудов, вызывая их разрушение и способствуя возникновению тромбозов и тромбоэмболий. Уровень антител к кардиолипину в сыворотке в норме: IgG – менее 19 МЕ/мл; IgА – менее 15 МЕ/мл; IgМ – менее 10 МЕ/мл. Нарастание уровня антител является чувствительным и специфическим лабораторным тестом, характеризующим риск возникновения тромботических осложнений. Больные, у которых обнаружен повышенный уровень антител к кардиолипину, относятся к группе риска по возникновению тромбозов при различных заболеваниях. При беременности из-за тромбоэмболических повреждений трофобласта и плаценты возможны гибель плода, выкидыш, отслойка плаценты, гипотрофия и гипоксия плода. При диагностике АФС определяются антитела класса IgG, IgA и IgМ. Более часто встречаются при АФС антитела к кардиолипину класса IgG и IgA, чем класса IgМ Уровень антител к кардиолипину в крови может колебаться как спонтанно, так и в ответ на какие-то патологические процессы в организме. При лечении АФС концентрация антител к кардиолипину может меняться, а может оставаться на прежнем уровне. Антитела класса IgМ наиболее быстро реагируют (их уровень снижается) на эффективное лечение АФС. Низкие уровни антител к кардиолипину класса IgМ могут быть обнаружены при ревматоидном артрите, синдроме Шегрена, лекарственно-индуцированной красной волчанке, болезни Лайма и сифилисе. Антитела к кардиолипину могут быть выявлены при следующих заболеваниях:тромбоцитопениях, гемолитической анемии, аутоиммунных заболеваниях, системной красной волчанке, ревматоидном артрите, ревматизме, узелковом периартериите, инфаркте миокарда, инсульте, нестабильной стенокардии, инфекциях (туберкулез, лепра, стафилококковая, стрептококковая инфекции, корь, мононуклеоз, краснуха, СПИД), артериальной гипертензии, облитерирующем эндартериите, системном атеросклерозе, угрозе развития тромботических осложнений, акушерской патологии с развитием АФС. Относительный риск развития инсультов, выкидышей или тромбозов глубоких вен у больных, имеющих в крови антитела к кардиолипину, в 2–4 раза выше, чем у пациентов, у которых они отсутствуют.

3. Антитела к b-2-гликопротеину 1. b-2-гликопротеин 1 (аполипопротеин Н) является кофактором, который необходим, чтобы в крови произошло взаимодействие антифосфолипидных антител с фосфолипидами. Установлено, что присутствие в крови именно b-2-гликопротеин 1 зависимых антител к кардиолипину ассоциируется с развитием АФС, в то время как при инфекционных заболеваниях образуются b-2-гликопротеин 1 независимые антитела к кардиолипину, наличие которых очень редко приводит к тромботическим нарушениям, характерным для АФС. Белок – b-2-гликопротеин 1 имеет мол. м. 50 кД, обладает естественной антикоагулянтной активностью, присутствует в нормальной плазме в концентрации около 200 мкг/мл и циркулирует в ассоциации с липопротеидами. Природа кофакторной активности b-2-гликопротеина 1 при АФС в настоящее время активно изучается. Предполагается, что при АФС антикардиолипиновые антитела взаимодействуют не с кардиолипином, а с конформационными эпитопами, формирующимися в процессе взаимодействия b-2-гликопротеина 1 с кардиолипином. Поэтому обнаружение антител к кардиолипину в сыворотке крови одновременно с антителами к b-2-глико-протеину 1 повышает специфичность диагностики АФС. Уровень антител к b-2-гликопротеину 1 в сыворотке в норме: IgG – менее 19 МЕ/мл; IgМ – менее 10 МЕ/мл. В здоровой популяции определение антител к b-2-гликопротеину 1 класса IgG, IgМ и IgА имеет специфичность 100 %, 93 % и 96 % соответственно.

4. Антитела к фосфатидилсерину аналогично антителам к кардиолипину, взаимодействуют с фосфолипидами мембран тромбоцитов и эндотелиальных клеток сосудов, вызывая их повреждение, что служит основой для развития тромбозов и тромбоэмболий. Фосфатидилсерин, еще один представитель класса фосфолипидов, входит в состав клеточных мембран различных тканей. Наибольшее количество фосфатидилсерина содержат мембраны тромбоцитов и эндотелиальных клеток сосудистой стенки, участвующие в свертывании крови.

5. Антитела к протромбину являются патогенными и напрямую ингибируют факторы коагуляции, что приводит к удлинению времени фосфолипидзависимых коагуляционных тестов. Протромбин (фактор II) обеспечивает создание на мембране поврежденных клеток комплекса факторов Va, Xa, и фосфолипидов, в результате чего в присутствии ионов Са²⁺ образуется протромбиназный комплекс, который осуществляет расщепление протомбина до тромбина, что в дальнейшем приводит к превращению фибриногена в фибрин. Антитела к протромбину ответственные за эффект волчаночного антикоагулянта, обнаруживаются и у пациентов без СКВ, страдающих АФС. Предполагают, что связывание протромбина с фосфолипидами клеточных мембран увеличивается в присутствии антител к протромбину, в результате чего другие факторы коагуляции не могут связаться с фосфолипидами; возможно этим и объясняется удлинение времени фосфолипидзависимых коагуляционных тестов. Имеется и другая точка зрения, согласно которой протромбин при наличии антител перекрестно реагирует с плазминогеном, вследствие чего фибриноген не может быть расщеплен в фибрин. В связи с этим можно полагать, что существует 2 различных вида антител к протромбину, которые могут усиливать или ингибировать свертывание крови.

При диагностике аутоиммунных заболеваний используются следующие группы тестов:

· Тесты, позволяющие обнаружить эффекторные механизмы и факторы, специфичные для АИЗ. Они обладают простотой в постановке (рутинностью) и высокой степенью ассоциации с поражениями тканей. К числу рутинных относятся определение концентрации С-реактивного белка, ревматоидного и антинуклеарного факторов и С3-компонента комплемента. Эти маркеры аутоиммунного процесса позволяют с достаточной точностью поставить диагноз и оценить активность патологического процесса.

· Тесты, предназначенные для определения структурно-функциональных характеристик иммунокомпетентных клеток. Они имеют вспомогательное для постановки диагноза значение, но важны для контроля эффективности терапии, а также для уточнения патогенеза заболевания.

Помимо специальных иммунологических тестов обязательно исследование общего анализа крови, мочи, белков острой фазы и других биохимических показателей с учетом клиники (тяжесть, острота, осложнения), проводимых в динамике заболевания и терапии.

Определение LE-клеток

На определении LE-клеток (Lupus Erythematosus cells - клетки красной волчанки) основан первый лабораторный метод диагностики системной красной волчанки, разработанный в 1948 г., и широко используемый в нашей стране до сих пор.

LE-феномен имеет три морфологических признака: тельце, розетка, LE-клетка (см. рис1.). LE-феномен является следствием как реакции антител, так и фагоцитоза опсонированного материала клеточных ядер.

Тельце образуется следующим образом. Известно, что LE сывороточный фактор представляет собой антиядерное аутоАт. В результате его соединения с составными частями ядер клетки последние погибают, ядра оголяются. Эти измененные, освобожденные от протоплазмы ядра лейкоцитов и представляют собой LE тельце. Под действием хемотаксиса около LE-тельца скапливаются активные сегментоядерные лейкоциты, образуя форму розетки.

Рис.1 Морфология LE-феномена

LE-клетки представляют собой зрелые нейтрофилы или моноциты с крупными гомогенными базофильными включениями в виде гомогенных аморфных глыбок, состоящих из деполимеризированных ДНК. Вследствие включения крупного свободного ядра других распавшихся клеток ядро фагоцита смещено к краю за счет включения. Таким образом, LE-клетка является конечной морфологической фазой LE-феномена.

In vivo LE-клетки присутствуют в периферической крови, перикардиальном и плевральном выпотах, а также в области поражения кожи. Тестом на выявление LE-клетокопределяют антитела к нуклеопротеидам в 75 (70-95)% случаев. Однако, выявление LE-клеток - трудоемкий и недостаточно чувствительный метод лабораторной диагностики системной красной волчанки, поэтому сейчас для диагностики этого и других аутоиммунных заболеваний используются более простые, легко воспроизводимые методы, основанные на определении антинуклеарных антител (иммунофлуоресцентным или иммуноферментным методами).