Диагностика инфекционных болезней, связанная с определением серологических маркеров (Аг и Ат)
Серологический метод представляет собой совокупность реакций, основанных на взаимодействии антиген-антитело (см.) и направленных на выявление в сыворотке крови и других жидкостях организма антител к антигенам возбудителей инфекционных болезней, либо собственно микробных антигенов. Серологический метод характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью. Большинство реакций этого метода просты в проведении и учете, доступны широкому кругу лабораторий, как правило, безопасны, экономичны, поддаются стандартизации. К недостаткам серологического метода можно отнести: 1) косвенный характер результата, когда об этиологии болезни судят не по выделению возбудителя, а по ответу (иммунному) организма на возбудитель; 2) необходимость парентерального вмешательства в организм больного; 3) в большинстве случаев позднюю постановку диагноза, что объясняется природной динамикой гуморального иммунного ответа; 4) возможность принять анамнестические Ат (как результат ранее перенесенного заболевания или вакцинации) за Ат к текущей инфекции. При определении микробных антигенов 3-й и 4-й недостатки отсутствуют, но необходимо учитывать особенности циркуляции антигенов разных микробов и соотносить эти особенности с возможностью взятия материала для исследования.
Этапы серологического метода:
1) взятие материалов для исследования. В большинстве случаев материалом является сыворотка крови. Ее получают после образования сгустка крови, кровь следует забирать в строго асептических условиях по стандартной методике. Сыворотку крови относительно долго можно хранить в замороженном состоянии. При некоторых заболеваниях материалом для исследования могут служить ликвор, моча, фильтрат испражнений, промывные воды бронхов, полости рта, глотки, носа,
2) выбор серологической реакции для данного случая зависит от цели исследования, предполагаемого заболевания, фазы болезни, материала для исследования, чувствительности реакции, возможностей конкретной лаборатории. Для выявления Ат, а также Аг используют реакции агглютинации (РА), пассивной гемагглютинации (РПГА)), иммунофлюоресценции (РИФ), торможения гемагглютинации (РТГА), преципитации, флоккуляции, реакцию связывания комплемента (РСК) и др.
3) постановка серологической реакции,
4) регистрация серологической реакции с целью определения присутствия серологических маркеров инфекции.
Разнообразным серологическим реакциям свойственно несколько общих характеристик:
1) так как любые серологические реакции являются реакциями взаимодействия Ат и Аг, то во всех случаях для установления присутствия Ат в исследуемом субстрате необходим набор известных стандартных корпускулярных или растворимых Аг, называемых диагностикумами. В свою очередь, для установления присутствия Аг нужен набор иммунных диагностических сывороток,
2) взаимодействие Аг и Ат осуществляется только в присутствии электролита, в качестве которого обычно используют изотонический раствор хлорида натрия или буферные смеси, рН системы должен быть около 7,
3) для образования комплекса Аг-Ат требуется период инкубации при особых температурных условиях (от +4 °С до 37 °С). Образование специфического иммунного комплекса происходит быстро; видимого простым глазом феномена (агглютинации, лизиса и др.) - медленно, через несколько часов или даже суток,
4) оба компонента серологической реакции (антиген и антитела) должны присутствовать в эквивалентном соотношении. Избыток какого-либо из компонентов блокирует образование комплекса Аг-Ат и способствует ложно отрицательным результатам.
В процессе оценки серологического метода часто возникает необходимость отличить специфическую реакцию (на видовые и типовые Аг) от группоспецифической (на межвидовые Аг) и иммунный ответ на текущую инфекцию - от иммунного ответа на перенесенное ранее заболевание и иммунизацию. В первом случае дифференциация основывается на использовании монодиагностикумов, скорости нарастания титра Ат, которая выше к специфическим Аг, реакции адсорбции Ат избытком Аг, легкости диссоциации иммунного комплекса под влиянием диссоциирующих факторов. Во втором случае для дифференциации применяют темпы нарастания титра Ат, которые выше при текущей инфекции, особенности проявления реакции и классов Ig, сопоставление результатов серологического метода с бактериологическими и клиническими данными.
Учет серологических реакций осуществляют визуально, иногда с помощью лупы. Суть учета серологической реакции сводится к определению феномена связывания Аг и Ат по образованию комплекса Аг-Ат. Визуально образование комплекса Аг-Ат сопровождается двумя основным феноменами - агглютинацией и преципитацией. Различия между ними определяются особенностями антигенов и антител, специфичных к ним. В то же время, среди микробных антигенов присутствуют и такие, которые индуцируют синтез непреципитирующих, образование комплекса Аг-Ат в данном случае не сопровождается ни феноменом агглютинации, ни феноменом преципитации, а выявление факта образования комплекса Аг-Ат требует маркирования диагностического компонента реакции специальными метками, либо перевода диагностического антигена в другое агрегатное состояние
При оценке реакции применяют 3 главных критерия: 1) наличие и интенсивность реакции (в плюсах и др.); 2) диагностический титр, 3) нарастание титра Ат в течение болезни в 4 раза и более. Наличие реакции устанавливают по визуальным феноменам или по связыванию иммунохимического маркера. Для оценки интенсивности серологической реакции используют принцип 4 "+".
Особый вопрос заключается в количественном выражении результатов серологической реакции, так как диагностика инфекционных болезней предполагает не только определение факта присутствия антител (антитела могут быть не только маркером протекающего инфекционного заболевания, но и - поствакцинального иммунитета, либо маркером перенесенного в прошлом заболевания), но и определение их количества. С этой точки зрения в настоящее время присутствует две равноправные возможности. Первая возможность касается непосредственного определения количества антигенспецифических антител, выражаемого в системе г/л. Для такого определения тест-система для постановки серологической реакции должна иметь специальный образец-стандарт с уже известным содержанием антигенспецифических антител. Этот стандарт используется для
построения калибровочного графика. Но в силу технологических проблем при приготовлении стандартов данный подход используется лишь в ограниченном числе тест-систем. Чаще применяют вторую возможность - определение количества Ат в виде титра. Для определения тира Ат (или титра Аг) необходимо поставить серологическую реакцию, приготовив ряд разведений сыворотки крови или иного материала (раститровать). При приготовлении разведений сыворотки крови используют раствор электролита (чаще всего изотонической раствор хлорида натрия).
Диагностический титр - это титр антител, характерный для большинства случаев конкретного инфекционного заболевания, определяемый на пике гуморального иммунного ответа. Диагностический титр определяется путем многочисленных исследований, выполняемых на базах различных лабораторий.
В то же время, есть ряд ситуаций, когда подтверждение диагноза инфекционного заболевания с помощью диагностического титра невозможно: 1) если определение титра антител осуществляется ранее, чем развивается гуморальный иммунный ответ, то, естественно, титр антител будет ниже диагностического, 2) при перенесении заболевания или после вакцинации в прошлом (в анамнезе), 3) при инфекциях, вызванных условно-патогенными микробами, в частности представителями нормальной микрофлоры. В этих случаях для подтверждения диагноза инфекционной болезни используется понятие "нарастание титра антител", т.е. оценивается динамика гуморального иммунного ответа. Критерием развития гуморального иммунного ответа является нарастание титра антител за 10 - 14 дней в 4 и более раз. Соответственно, для определения нарастания титра антител исследованию подвергаются 2 образца сыворотки крови, взятых с указанным интервалом
Иммуноферментный метод (иммуноферментный анализ, ИФА)- определение Аг или Ат с помощью Ат или Аг, ковалентно соединенных с ферментом (чаще пероксидазой хрена, реже - b-глюкуронидазой, щелочной и кислой фосфатазами). Образующийся иммунный комплекс выявляют с помощью фотометрического измерения оптической плотности окрашенных продуктов, которые образуются в результате ферментативного расщепления субстрата ферментом. Иммуноферментные реакции применяют для диагностики инфекционных болезней (СПИДа, вирусных гепатитов, хламидиоза, токсоплазмоза и др.), определения содержания гормонов, и др. Для метода характерна высокая специфичность и чувствительность; высокий уровень автоматизации создается благодаря наличию специальных анализаторов и стандартных тест-систем. Различают прямой способ, когда ферментом метят специфические Ig (Ат), и непрямой, при котором иммунный комплекс выявляют мечеными антииммуноглобулинами.
Иммунофлюоресцентный метод (РИФ, реакция иммунофлюоресценции) - метод выявления специфических Аг (Ат) с помощью Ат (Аг), конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Применяется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний (идентификация возбудителя в исследуемом материале), а также для определения Ат и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. клеток. Прямая РИФ состоит в обработке среза ткани или мазка из патологического материала или микробной культуры специфическими Ат, конъюгированные с флюорохромом; препарат промывают для освобождения от несвязанных Ат и исследуют в люминесцентном микроскопе. В положительных случаях по периферии объекта появляется светящийся иммунный комплекс. Необходим контроль для исключения неспецифического свечения. При непрямой РИФ на первом этапе срез ткани или мазок обрабатывают нефлюоресцирующими специфическими антителами, на втором -- люминесцирующими антителами к g-глобулинам того животного, сыворотка которого была применена на первом этапе. В положительном случае образуется светящийся комплекс, состоящий из Аг, Ат к нему и Ат против Ат (сэндвич-метод).
Иммунохроматографический метод основан на ИФА. Но все диагностические компоненты сорбированы на специальном носителе. Исследуемый материал (в объеме порядка 10 мкл) помещается на один из концов этого носителя и всасывается в него, при соответствии антител исследуемого материала и диагностических компонентов (т.е. антигенов возбудителя) происходит их связывание, проявляющееся окрашиванием полоски носителя. В настоящее время данный метод применяется в качестве экспресс-диагностики инфекционных заболеваний.
ПЦР дает возможность существенно ускорить и облегчить диагностику вирусных заболеваний. Нужный ген амплифицируют с помощью ПЦР с использованием соответствующих праймеров, а затем секвенируют для определения мутаций. Вирусные инфекции можно обнаруживать сразу после заражения, за недели или месяцы до того, как проявятся симптомы заболевания