Гельпроникающая (молекулярно-ситовая) хроматография
Гельпроникающая хроматография (ГПХ) представляет собой метод разделения молекул, основанный на различии из размеров.
В качестве НФ в ГПХ используют частицы, имеющие определенные размеры пор. Это различного рода гели (мягкие, полужесткие и жесткие). В качестве ПФ служат водные или органические элюенты. Принцип разде-ления молекул в ГПХ состоит в том, что молекулы анализируемых ве-ществ распределены между неподвижным растворителем в порах сорбента и растворителем, протекающим через слой НФ. Молекулы, которые имеют размеры, позволяющие им проникать в поры сорбента при движении вдоль колонки, часть времени теряют на пребывание в порах. Молекулы, имею-щие размеры, превышающие размеры пор, не проникают в сорбент и вы-мываются из колонки со скоростью движения элюента. Молекулы, кото-рые проникают в поры всех размеров, движутся наиболее медленно. Сни-жение скорости движения веществ вдоль колонки тем больше, чем в боль-шее число пор способны диффундировать распределяемые частицы.
Таким образом, при помощи ГПХ можно разделить смеси веществ в за-висимости от размеров их молекул. Выход веществ из колонки происходит в порядке уменьшения их молекулярной массы. Так можно разделить полипептиды, белки и другие макромолекулы.
Гельпроникающая хроматография на колонке используется для очистки пестицидов, а также жирорастворимых витаминов перед их определением методом ВЖХ.
Электрофорез
Метод анализа, основанный на способности заряженных частиц к пере-движению во внешнем электрическом поле называют электрофорезом (от “электро” и греческого phoresis -- перенесение).
Электролиз относится к методам разделения без превращения веществ, на основе заряда частиц. По технике выполнения метод аналогичен хроматографии, поэтому и рассматривается в этой главе.
Рис 3.5.1. Схема прибора для электрофореза.
Нередко под электрофорезом понимают перемещение коллоидных час-тиц или макромолекул, в отличие от иовофореза - перемещения неоргани-ческих ионов малого размера.
Передвижение частиц при электрофорезе зависит от ряда факторов, ос-новными из которых являются: напряженность электрического поля; вели-чина электрического заряда; скорость и размер частицы; вязкость, рН и температура среды, а также продолжительность электрофореза.
Электрофорез можно проводить как в свободном растворе (фронталь-ный электрофорез), так и на носителях (зональный электрофорез). Послед-ний вариант предпочтительнее, т.к. носители способствуют стабилизации электрофоретических зон. В качестве носителей используют: фильтро-вальную бумагу, силикагель, крахмал, оксид алюминия, поливинилхлорид, агаровый и полиакриламидный гели и др.
Электрофоретическое разделение осуществляют на бумаге, в тонком слое сорбента, колонке или в блоке (который часто формируют из суспен-зии крахмала в подходящем электролите).
Аппаратура для электрофо-реза выполняется по единой схеме: источник тока, камера для электрофореза, два элек-трода, соединяющих камеру с источником тока и приспособ-ление для сбора и идентифика-ции разделенных веществ (по-следний блок в некоторых слу-чаях отсутствует). Для элек-трофореза используют как готовые наборы аппаратуры (универсальный прибор для иммуноэлектрофореза и электрофореза белков на бумаге и крахмале, набор для электрофоре-
за в полиакриламидном геле венгерской фирмы Реанал), так и наборы, со-ставляемые экспериментатором из отдельных приборов.
На рис. 3.5.1 представлена схема прибора для электрофореза на бумаге. Электрофоретическая камера состоит из двух кювет, в которые помещают графитовые электроды и раствор проводящей жидкости (буферный рас-твор). Выше кювет находится подставка для носителя бумаги. Смесь ве-ществ, подлежащих разделению, наносят на пропитанную проводящей жидкостью бумагу. Бумагу подсушивают, помещают на подставку, концы погружают в кюветы, затем камеру плотно закрывают крышкой. После пропитывания бумаги проводящей жидкостью подключают электрический ток. По окончании электрофореза бумагу подсушивают. Качественную и количественную оценку осуществляют, применяя методы, используемые в бумажной хроматографии, например, проявление белков с помощью кра-сителей, количественную оценку - методом денситометрии.
Важной областью применения электрофореза является анализ белков сыворотки крови, аминокислот гидролизатов белков, нуклеиновых кислот и т.п. В кислотном буферном растворе аминокислота находится в виде катиона NHз+......COOH, который будет перемещаться к катоду, в то время как в щелочном буфере аминокислота превращается в анион NH2....COO-, и будет дви-гаться к аноду. В изоэлектрической точке аминокислота находится в растворе в виде биполяр-ного иона NH3+......COO- и не будет передвигаться в электрическом поле.
Рис. 3.5.2. Электрофореграмма (а) и схемы (б) белковых фракций.
A - белковые фракции сыров: 1, 17 - российского, 2, 16 - волжского, 3, 15 - “Орбита”, 4, 14 - колбасного, 5, 13 - голландского, 6, 12 - пошехонского, 7, 11 - “сырного” казеина после осаждения при pH 4,6, 8, 10 - молочной сыворотки, 9 - казеина по Гаммерстену, 18 - “городского”.
Б - белковые фракции сыра (I), сырного казеина (II)
Ввиду того, что отдельные белки и аминокислоты имеют различные изоэлектрические точки, при определенном значении рН они будут двигаться с различной скоро-стью. Подбирая соответствующие буферные растворы для установления определенной скорости движения и растворимости веществ, можно ис-пользовать электрофорез для их разделения. Метод позволяет разделять вещества, различие в изоэлектрической точке которых составляет до 0,02 единиц рН. Градиент рН в 0,02 единицы часто достигают прибавлением амфолитов, представляющих собой готовую смесь алифатических полиаминаполикарбоновых кислот.
Электрофоретическое разделение белков широко используется для оценки качества мяса и мясных продуктов, для дифференцирования вида мяса и рыбы. Метод также применяется для выявления немясных добавок (белков молока, сои, яиц) в мясных продуктах. С помощью электрофореза в полиакриламидном геле можно охарактеризовать изменение белков в процессе созревания сыров (рис.3.5.2).
В настоящее время используют высокоэффективный капиллярный электрофорез, например, для анализа витаминов в диетических продуктах (жирорастворимых А, Е, К, Д; водорастворимых - B1, B2, B6, B12, С, никотинамида); и для определения анионов (сульфат - хлорид-, иодид-) в мо-лочных продуктах.
Газовая хроматография
В газовой хроматографии (ГХ) в качестве ПФ используют инертный газ (азот, гелий, водород), называемый газом-носителем. Пробу подают в виде паров, неподвижной фазой служит или твердое вещество - сорбент (газо-адсорбционная хроматография) или высококипящая жидкость, нанесенная тонким слоем на твердый носитель (газожидкостная хроматография). Рас-смотрим вариант газожидкостной хроматографии (ГЖХ). В качестве носи-теля используют кизельгур (диатомит) - разновидность гидратированного силикагеля, часто его обрабатывают реагентами, которые переводят груп-пы Si-OH в группы Si-О-Si(CH3)3, что повышает инертность носителя по отношению к растворителям. Таковыми являются, например, носители “хромосорб W” и “газохромQ”. Кроме того, используют стеклянные мик-рошарики, тефлон и другие материалы.
Неподвижную жидкую фазу наносят на твердый носитель. Эффектив-ность разделения в газожидкостной хроматографии зависит главным обра-зом от правильности выбора жидкой фазы. При этом полезным оказалось старое правило: “подобное растворяется в подобном”. В соответствии с этим правилом для разделения смеси двух веществ выбирают жидкую фа-зу, близкую по химической природе одному из компонентов. Подготов-ленный носитель помещают в спиральные колонки, имеющие диаметр 2 - 6 мм и длину до 20 м (набивные колонки). С 1957 года стали применять предложенные Голеем капиллярные колонки, имеющие диаметр 0,2 - 0,3 мм и длину в несколько десятков метров. В случае капиллярных колонок жидкая фаза наносится непосредственно на стенку этого капилляра, кото-рая выполняет роль носителя. Применение капиллярных колонок способ-ствует повышению чувствительности и эффективности разделения много-компонентных смесей.
Рис.3.6.1. Блок-схема газового хроматографа.
Анализ методом ГХ выполняют на газовом хроматографе, принципи-альная схема которого приведена на рис. 3.6.1.
Газ - носитель из баллона 1 с постоянной скоростью пропускают через хроматографическую систему. Пробу вводят микрошприцем в дозатор 2, который нагрет до температуры, необходимой для полного испарения хроматографируемого вещества. Пары анализируемой смеси захватывают-ся потоком газа - носителя и поступают в хроматографическую колонку, температура которой поддерживается на требуемом для проведения анали-за уровне (она может быть неизменной, или по необходимости меняться в заданном режиме). В колонке анализируемая смесь делится на компоненты, которые поочередно поступают в детектор. Сигнал детектора фиксируется регистратором (в виде пиков) и обрабатывается вычислительным интегратором.
В ГХ используют детекторы, которые преобразуют в электрический сигнал изменения физических или физико-химических свойств газового потока, выходящего из колонки, по сравнению с чистым газом - носителем. Существует множество детекторов, однако широкое применение находят только те из них, которые обладают высокой чувствительностью и универ-сальностью. К таким относятся: катарометр (детектор по теплопроводно-сти); пламенно-ионизационный детектор (ПИД), в котором водородное пламя служит источником ионизации органического соединения; детектор электронного захвата (ЭЗД); термоионный детектор (ТИД), который обла-дает высокой селективностью к органическим веществам, содержащим фосфор, азот и серу. Интерес к этому детектору заметно возрос в связи с заменой хлорсодержащих пестицидов на фосфорсодержащие ядохимика-ты, используемые в сельском хозяйстве и попадающие затем в пищевые продукты.
Катарометр позволяет определить концентрации веществ в пределах 0,1 - 0,01%, ПИД - 10-3 - 10-5%”; ЭЗД - 10-6 - 10-10%. Современные детекторы позволяют определять даже пикограммы (10-12 г) вещества в пробе.
Качественный и количественный анализ в методе ГХ проводят так же, как и в ВЖХ.
Газожидкостная хроматография находит широкое применение для раз-деления, идентификации и количественного определения сложных много-компонентных систем, таких как нефть, биологические жидкости, пище-вые продукты, парфюмерно-косметические изделия и многие другие. Ме-тод отличается высокой чувствительностью, экспрессностью; для анализа не требуется большого количества исследуемого образца.
Среди разнообразных хроматографических методов газовая и высоко-эффективная жидкостная хроматография являются самыми перспективны-ми для решения сложных задач в практике пищевого анализа.
Так, в число задач, которые могут быть разрешены в пищевом анализе с помощью этих методов, входят:
- определение химической природы веществ, обуславливающих характерный аромат свежих продуктов;
- контроль за состоянием продуктов в процессе обработки и хранения;
- объективная оценка показателей, характеризующих качество исходного сырья и готовых изделий из него;
- установление и устранение причин, вызывающих нежелательные изменения продуктов в процессе их изготовления;
установление факта фальсификации продукта и другие.
Рис.3.6.2. Хроматограмма афлотоксинов в молоке. Регистрация с помощью флуометрического детектора (возбуждающая длина волны 365 нм, возбужденная 455 нм).
Методами ГХ и ВЖХ идентифицируют и определяют летучие вещества, участвующие в формировании вкуса и аромата многих пищевых продуктов или отвечаю-щих за их порчу. Например, определяют летучие жирные кислоты, характерные для качест-венного мяса; или кислоты, образующиеся при изменении нормального процесса брожения квашеной капусты и обуславливающие посторонние оттенки ее запаха. Методы используются для определения никотина, нитрозамина (в рыбе и копченостях); пищевых добавок (красители, консер-ванты, антиокислители); загрязнителей окружающей среды (пестициды, афлатоксины, остатки лекарственных препаратов, витамины) и др. На рис. 3.6.2 представлена хроматограмма разделения афлатоксинов в молоке.