Современные методы молекулярной биологии

ПЦР.В настоящее время метод амплификации нуклеиновых кислот полимеразной цепной реакцией (ПЦР) широко используется в практической медицине. Основным достоинством метода ПЦР является чрезвычайно высокая чувствительность анализа - до 1 копии геномной ДНК возбу­дителя инфекции в исследуемой пробе до 100 копий генома в исследуемой пробе.

Возможности, заложенные в методе ПЦР, позволяют достигать максимальной специфичности анализа, т.е. способности выявлять ДНК конкретного инфекционного агента в присутствии ДНК других микроорганизмов и ДНК организма-хозяина. К настоящему времени метод автоматизиро­ван и позволяет, при необходимости, получать результаты анализа в течение одного рабочего дня.

ПЦР в настоящее время используется для: ранней диагностики инфекционных заболеваний у серонегативных пациентов, когда лечение наиболее эффективно; выявления персистирующих, ла­тентных и рецидивирующих форм инфекций; контроля эффективности лечения; диагностики оп­портунистических инфекций, часто протекающих на фоне иммунодефицита, вследствие чего по­становка диагноза только по результатам серологических исследований затруднена из-за имеющихся несоответствий между параметрами иммунного ответа и протёкания заболевания; раз­решения сомнительных результатов серологических исследований; эпидемиологических исследо­ваний; выявления наиболее патогенных штаммов инфекционных агентов; исследования инфекци­онности пулированных образцов крови и ее продуктов, применяемых в терапии.

Инфекционный агент: Вирус гепатита В, Вирус гепатита С, Цитомегаловирус, Вирус просто­го герпеса, Вирус Эпштейна-Барра. Герпес-вирус типа 6 (HHV-6), Хламидии (trachomatis). Уреа-плазмы (urealiticum), Микоплазмы (hominis), Трихомонас (vaginalis), Гонококки (Gonorrhoeae neisseria), Гарднерелла (vaginalis), Листерии (monocytogenes), Микобактерий (tuberculosis), ВИЧ, выявление мутации в гене CKR-5 и др.

Ход исследования:

На первой стадии при температуре 94°С (или выше) происходит денатурация двойной цепи исследуемой ДНК (стадия денатурации).

На второй стадии используют праймеры, строго специфичные к определенным участкам цепей исследуемой ДНК они связываются с этими участками ДНК (стадия отжига). На третьей стадии при температуре 70-72°С с участием термофильной ДНК-полимеразы проис­ходит синтез новых цепей ДНК. Инициация синтеза ДНК происходит в местах связывания праймеров с исследуемой ДНК, матрицей для синтеза служат исходные цепи ДНК (стадия полимери­зации).

Таким образом, за цикл, включающий три стадии, происходит удвоение каждой из двух цепей ДНК. При проведении 20 таких циклов теоретически происходит увеличение количества исходной ДНК в миллион и более раз. Образовавшийся специфический продукт ПЦР (ампликон) в подав­ляющем большинстве случаев детектируют методом электрофореза в агарозном или полиакриламидном гелях, сравнивая с контрольными образцами.

Для ПЦР-анализа РНК-содержаших инфекционных агентов предварительно проводят стадию обратной транскрипции - получения ДНK, комплементарной вирусной РНК-матрице, для чего ис­пользуют специфические праймеры к РНК и фермент - РНК-зависимую ДНК-полимеразу (обрат­ную транскриптазу). Далее ПЦР-анализ проводят по схеме, описанной выше.

Для ПЦР анализа используют разнообразный клинический материал: кровь, сыворотку крови, форменные элементы крови, мочу, слюну, соскобы и мазки со слизистых, ликвор, слезную жид­кость, содержимое везикул, биоптаты органов и тканей. Для исключения контаминации забор проб производят только одноразовым инструментарием (шприцы, соответствующие зонды, пробоот­борники и пр.). Взятый материал помещают в одноразовые пробирки (например, типа "Эппендорф") Для более эффективного использования результатов ПЦР-анализа врачами-клиницистами при постановке, подтверждении диагноза или контроле за лечением нами предложена следующая, система полуколичественной оценки результатов анализа: + - 50-500 копий геномов на пробу; ++ - 500-5000 копий геномов на пробу; +++ - 5000-50000 копий геномов на пробу; ++++ - более 50000 копий геномов на пробу;

ИММУНОБЛОТТИНГ

Качественный метод, позволяющий выявлять антигены и антитела в исследуемой пробе.

Для выявления антител:

Исследуемую сыворотку больного инкубируют с известными антигенами нанесенными на нитроцеллюлозную мембрану, затем добавляют меченную диагностическую сыворотку против иммуноглобулинов человека.

Для выявления антигена:

С помощью электрофореза разделяют белки в исследуемой пробе от больного, затем их пере­носят на нитроцеллюлозную мембрану и добавляют меченную диагностическую сыворотку против известных антигенов

Иммуноблоттинг широко применяется для подтверждения твердофазного иммуноферментного анализа.