Краткий курс по общей микробиологии, иммунологии, санитарной и частной микробиологии

КРАТКИЙ КУРС

общей микробиологии, иммунологии, санитарной и частной микробиологии

к практическим занятиям для студентов лечебного, медико-профилактического, стоматологического, фармацевтического факультетов и факультета высшего сестринскою образования

Рязань 2003

УДК 576.8

Составители:доцент В.И. Коноплева,доцент О.В. Евдокимова,

ст. преподаватель К.А. Силин,асс. В.В. Царьков

Под редакцией ст. преподавателя кафедры микробиологии К.А. Силина

Рецензенты:зав. кафедрой инфекционных болезней РязГМУ проф. Е.Р.Корвякова,

зав. кафедрой общей гигиены с курсом экологии РязГМУ проф. А.А. Ляпкало

Краткий курс по общей микробиологии, иммунологии, санитарной и частной микробиологии

к практическим занятиям для студентов лечебного, медико-профилактического, сто­матологического, фармацевтического факультетов ифакультета высшего сестрин­ского образования; В.И. Коноплева, О.В. Евдокимова, К.А. Силин, В.В. Царьков. - Ря­зань, РГМУ. - 2003. - 80 с.

© Составители, 2003

© Рязанский государственный

медицинский университет, 2003

ВВЕДЕНИЕ

ПОНЯТИЕ О МИКРОБАХ

Объектомизучения микробиологии являются микроорганизмы (микробы) - мельчайшие не­видимые одноклеточные и многоклеточные существа, которые по многообразию не уступают представителям животного или растительного царства.

Особенности микробов:

- малые размеры (обычно их измеряют в микрометрах, 10^{-6 м, мкм);}

- слабая морфологическая дифференцировка (относительно простое строение);

- быстрый рост и размножение (в благоприятных условиях одна особь за сутки может дать потомство в сотни миллионов особей);

- высокая активность обменных процессов (быстрый синтез и разложение веществ,
получение энергии);

- повсеместное распространение (связано с выраженной способностью к адаптации).

Микробиология является комплексом наук. В зависимости от объекта исследования различа­ют: бактериологию, вирусологию, микологию (объект - грибы), протозоологию (объект - простей­шие). По целям изучения микробиология делится на общую, медицинскую, санитарную, ветери­нарную, промышленную, космическую и др.

Задачи медицинской микробиологии:

1. Изучение биологии патогенных (болезнетворных) и нормальных для человека микробов.

2. Изучение роли микробов в возникновении, развитии инфекционных (заразных) болезней и формировании иммунного ответа макроорганизма ("хозяина").

3. Разработка методов микробиологической диагностики (распознавания), специфического
лечения и профилактики (предупреждения) инфекционных болезней человека.

Микробиологические исследования проводятся в специальных научных или практических лабораториях, где поддерживается противоэпидемический режим. Соблюдение особых правил ра­боты в лаборатории преследует 2 цели: а) исключить возможность внутри лабораторного заражения и выноса инфекции за пределы лаборатории; б) предотвратить микробное загрязнение воздуха, оборудования и материалов, снижающее качество анализа.

МОРФОЛОГИЯ И ФИЗИОЛОГИЯ МИКРОБОВ

Химический состав бактериальной клетки.

Основными веществами, входящими в ее состав являются: вода(свободная и связанная), нук­леиновые кислоты (ДНК и РНК), белки, углеводы, липиды и минеральные соли. Свободная вода, являясь универсальной дисперсионной средой, участвует в метаболизме, связанная вода - опреде­ляет устойчивость клетки к физическим факторам. Нуклеиновые кислоты являются носителями наследственной информации. Белки входят в состав различных структур бактериальной клетки, являются составной частью ферментов, токсинов, антигенов, определяют отношение к красителям, лекарственным и дезинфицирующим веществам. Углеводы являются источником энергии, и, наря­ду с белками, могут определять специфичность бактерий. Липиды определяют заряд клетки и про­ницаемость мембран, устойчивость к кислотам, щелочам, спиртам, а также токсичность микроба.

Стерилизация

Стерилизация - полное обеспложивание объектов, при котором уничтожаются все формы микроорганизмов (вегетативные и споры). Для стерилизации применяют физические и химические методы. Выбор метода определяется видом стерилизующего материала, который после стерилиза­ции должен сохранять свои основные свойства (форму, эластичность, активность и др.). Физиче­ские методы - действие высокой температуры, ионизирующего излучения, фильтрование через коллоидные фильтры.

Дезинфекция

Дезинфекция - комплекс мероприятий, направленных на уничтожение в объектах конкретных патогенныхмикробов. После дезинфекции могут сохраняться непатогенные микробы. В медицине применяют физические и химические методы дезинфекции.

1. Физические методы: 1) механические (вытряхивание, проветривание, влажная уборка, стирка с мылом); 2) действие высокой температуры (прокаливание утюгом, кипячение, пастериза­ция); 3) УФО (облучение бактерицидными лампами).

2. Химические методы - применяют в различных концентрациях следующие дезинфицирую­щие вещества: I) хлорсодержащие препараты (хлорная известь, хлорамин Б, гипохлорит кальция, хлоргексидин и др.); 2) окислители (перекись водорода, перманганат калия); 3) фенолы (карболо­вая кислота, лизол); 4) йод и йодофоры (йод + ПАВ); 5) соли тяжёлых металлов (сулема, диоцид, мертиолят); ПАВ (сульфанол); 7) четвертичные аммонийные соединения (роккал); 8) 70% эта­нол; 9) формалин; 10) красители (бриллиантовый, зеленый); II) кислоты (салициловая, борная и др.).

Механизм дезинфекции различен: механическое удаление; коагуляция белков при нагрева­нии; хлорсодержащие препараты и формалин взаимодействуют с аминогруппами белков, окисли­тели - с сулъфгидрильными группами; фенолы повреждает клеточную стенку и нарушают процес­сы дыхания, соли тяжелых металлов образуют альбуминаты белков, ПАВ изменяют заряд клеточных мембран, четвертичные аммонийные соединения нарушают процессы дыхания, краси­тели взаимодействуют с нуклеиновыми кислотами и т.д.

Асептика- система профилактических мероприятий, направленных на предотвращение по­падания в рану, лекарственные препараты микроорганизмов. Она включает: I) стерилизацию инст­рументов, приборов, материалов; 2) специальную обработку рук перед асептичной работой; соблюдение определенных правил и приёмов работы (стерильный халат, маска, перчатки, исключение разговоров и т.п.); 4) осуществление специальных санитарно-противоэпидеческих и гигиенических мероприятии (правильная вентиляция, влажная уборка с применением дезинфицирующих средств, облучение бактерицидными лампами).

Антисептика- комплекс мероприятий , направленных на уничтожение микробов, попавших в рану, лекарственный препарат или другой объект. Применяют антисептику: I) механическую, например, удаление из раны инфицированных или нежизнеспособных тканей при обработке раны; 2) физическую (наложение гигроскопических повязок, применение гипертонических растворов, способствующих оттоку раневого, отделяемого в повязку, сухого тепла, УФС. лазера и т.д. 3) химическую (применяют химические вещества, обладающие бактерицидными или бактериостатическим действием при минимальном органотропном действии, например хлоргексидин; в лекарственные препараты вносят борную кислоту, мертиолят и др.); 4) биологическую (применение анти­биотиков, бактериофагов, иммуноглобулинов, средств, стимулирующих защитные силы организ­ма).

Пастеризация - однократное кратковременное прогревание при температуре ниже 80°С, частичное обеспложивание продуктов только от болезнетворных бактерий. Как и кипячение, пастеризация не является методом стерилизации. После пастеризации сохраняются споры и вегетативные формы, поэтому пастеризованный продукт (молоко, соки и т.д.) хранят в холодильнике.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ РАБОТЫ ЦЕНТРАЛИЗОВАННЫХ СТЕРИДИЗАЦИОННЫХ ОТДЕЛЕНИЙ (ЦСО) В ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ УЧРЕЖДЕНИЯХ

Эти отделения созданы для предупреждения парентеральных заражений вирусным гепати­том, ВИЧ-инфекцией, малярией, сифилисом и другими заболеваниями, а также постинфекционных осложнений. ЦСО осуществляет: 1) приём использованного и предварительно очищенною инст­рументария; 2) мойку инструментов с целью очистки от остатков лекарственных веществ и крови (с последующей проверкой на наличие следов крови и моющих средств по бензидиновой, амидопириновой и фенолфталеиновой пробе); 3) упаковку инструментов, перчаток, перевязочного мате­риала ведут в специальную бумагу, двойной слой мягкой упаковки, биксы; 4) стерилизацию, ко­торая проводится в паровых стерилизаторах (температура 120°С, Р=1 атм., экспозиция 45 минут; температура 132°С, Р=2 атм., экспозиция 20 минут - так стерилизуют перчатки, инструментарий, перевязочный материал, бельё),в воздушных стерилизаторах (температура 180°С, экспозиция 60 минут - так стерилизуют шприцы, металлические катетеры, шпатели, изделия из стекла и метал­ла).

Стерильный материал в биксах или двойной мягкой упаковке хранят не более 3 суток, в пер­гаменте - не более 3 недель.

ФИЗИОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ

Ферменты микробов

В микробной клетке ферменты катализируют многочисленные процессы биосинтеза клеточ­ных структур и получения энергии. У бактерий обнаруживаются основные группы ферментов: гидролаза, оксидоредуктазы, трансферазы, липазы, лигазы, изомеразы. Часть из них (экзоферменты) выделяется наружу, осуществляя внеклеточные реакции: расщепление макромолекул пита­тельных веществ до простых соединений, разрушение антибиотиков (например, бета-лактамаза инактивирует пенициллин) и др. Эндоферменты катализируют реакции внутри клетки: располо­женные в цитоплазматической мембране пермеазы переносят питательные вещества в клетку, оксидоредуктазы обеспечивают получение энергии и т.д. Кроме того, болезнетворные бактерии мо­гут обладать ферментами, выполняющими функцию факторов патогенности. Например, гиалуронидаза расщепляет основное вещество соединительной ткани, фибринолизин участвует в растворении кровяных сгустков, что способствует распространению возбудителя в организме.

Ферменты обладают высокой специфичностью и многообразием у микробов. По индивидуальному набору ферментов (биохимическим свойствам) часто определяют вид микроба. Наибольшее значение при идентификации бактерий имеет определение сахаролитических и потеолитических свойств. При этом изучаемый микроорганизм помещают в питательную среду, содержащую субстрат (углевод или белок) и индикатор. О наличии фермента судят по изменению цвета индикатора, который реагирует на продукты разложения субстрата.

Микробные ферменты широко используют в биотехнологии и медицине. С их помощью осу­ществляют генноинженерные исследования, получают биологически активные вещества, вакцины, сыворотки. В медицине, например, для улучшения пищеварения применяют амилазу и диастазу из аспергиллов, для заживления ран (ожогов) - коллагеназу из клостридий.

ГЕНЕТИКА БАКТЕРИЙ

Микроорганизмы послужили удобной моделью для генетических исследований приведших к важнейшим открытиям 21 века в биологии: показано, что материальным носителем (основой)наследственности являются нуклеиновые кислоты - ДНК и РНК; установлено детальное строение хромосомы; расшифрованы механизмы генетического обмена и его регуляции, достижения генетики микроорганизмов послужили основой для становления и развития новой перспективной отрасли - биотехнологии. Она призвана использовать свойства микробов и клеточныхкультур, биологических процессов в производстве: биологически-активных веществ (антибиотиков, гормонов, белков, аминокислот), энергоносителей, полезных новых видов микробов, сортов растений, видов животных, эффективных вакцин, а также в борьбе с загрязнением окружающей среды и болезнями растений.

Микробы как объекты генетических исследований, обладают рядом преимуществ: бактерии содержат гаплоидный набор генов, поэтому изменения их генотипа с неизбежностью влекут за со­бой изменение фенотипа; для них характерно быстрое размножение и огромная численность по­томства (быстрая смена поколений); работа с микробами не требует больших затрат.

БАКТЕРИОФАГИ

БАКТЕРИОФАГИ - вирусы бактерий, которые обладают способностью лизировать бактери­альную клетку или изменять ее свойства. Фаги размножаются в клетках чувствительных к ним бактерий.

Строение фага кишечной палочки (Т₂)

Средние размеры фагов - 25-110 нм.

По характеру взаимодействия с чувствительной клеткой фаги различают:

а) вирулентные (дают литическую продуктивную инфекцию);

б) умеренные (вызывают лизогенизацию клетки).
По специфичности различают:

а) полифаги (лизируют несколько видов бактерий);

б) монофаги (лизируют только один вид бактерий);

в) типовые фаги (лизируют не все штаммы данного вида, а лишь некоторые, принадлежащие к одому фаговару).

Этапы взаимодействия вирулентного фага с клеткой:

1. Адсорбция фага на специфических рецепторах клеточной стенки (с участием фибрилл и отростка).

2. Проникновение нуклеиновой кислоты фага внутрь бактериальной клетки (лизоцим отрост­ка фага растворяет клеточную стенку бактерии в месте адсорбции, чехол сокращается, стержень проходит сквозь клеточную стенку и нуклеиновая кислота фага поступает внутрь бактериальной клетки, оболочка головки остается снаружи).

3. Синтез в клетке компонентов фага (проникшая нуклеиновая кислота фага вызывает пол­ную перестройку метаболизма клетки; на рибосомах синтезируются белки фага, а в других участ­ках клетки реплицируется его нуклеиновая кислота).

4. Сборка фаговых частиц и лизис клетки (нуклеиновая кислота наполняет белковые головки пристраивается отросток; лизоцим фага растворяет клеточную стенку бактерии, клетка лизируется, и из нее выходят 100-300 новых фагов; они внедряются в соседние клетки и также лизируют их; в результате мутная культура бактерий на жидкой среде просвегляется, а на плотной среде образует­ся колония фага - "стерильное пятно").

Титрование фагов

Активность препарата фага определяется его титром. Титр фага - наибольшее его разведение, еще вызывающее лизис чувствительной культуры бактерий.

Фаги титруют следующими методами.

/. Титрование фага на жидкой среде

Готовят последовательные десятикратные разведения испытуемого фага в жидкой питатель­ной среде; 10^-1, 10^-2, 10^-3, и т.д. В эти разведения вносят чувствительную культуру бактерий. Про­бирки инкубируют в термостате при 37°С 18-20 часов. Затем отмечают наибольшее разведение фа­га, ещё вызывающее лизис внесённой культуры (рост бактерий в этой пробирке отсутствует). Это разведение, и является титром фага. Например: "титр фага - 10^-6"

2. Титрование фага на плотной среде

Чашку с плотной средой делят на несколько зон. Культуру чувствительных бактерий высева­ют сплошным газоном на поверхность среды. Затем в соответствующие зоны наносят по капле различных десятикратных разведений фага. После инкубации в термостате при 37°С 18-20 часов отмечают наибольшее разведение фага, ещё вызывающее лизис (образование "стерильного пят­на").

ИНФЕКЦИЯ

Различают несколько форм взаимодействия (симбиоза) двух биологических видов, в том чис­ле паразитизм, когда один живёт за счет другого, нанося ему вред ( +- ). Паразит, как правило, за­висит от хозяина. Частным случаем паразитизма является инфекция.

Инфекция (инфекционный процесс)- это закономерно развивающийся процесс взаимодей­ствия микроба и восприимчивого макроорганизма, сопровождающийся физиологическими и пато­логическими реакциями, нарушением гомеостаза и функций организма.

Инфекционная болезнь - крайняя (по выраженности) форма инфекции.

ИММУНИТЕТ

Виды и формы иммунитета

Различают, иммунитет тканевой (обусловливает несовместимость тканей) и антиинфекцион­ный (противомикробный и противопаразитарный).

Антиинфекционный иммунитет включает: естественную резистентность (неспецифическая защита) и приобретённый иммунитет (специфическая защита).

Естественная резистентность представлена:

а) видовой невосприимчивостью (невосприимчивость к микробам, патогенным для других
видов),

б) невосприимчивостью при генетических отклонениях от нормы (например, люди с серповидной формой эритроцитов не болеют малярией),

в) собственно естественной резистентностью.

Приобретенный иммунитет имеет следующие формы:

1)активный (в его создании принимает участие собственная иммунная система), в том числе:

а) постинфекционный (после перенесённого заболевания),

б) поствакцинальный (после введения вакцинного препарата),

2) пассивный (когда в организм вводятся готовые специфические антитела или иммуноциты),
в том числе:

а) плацентарный (передаваемые от матери через плаценту плоду антитела),

б) постсывороточный (после введения иммунной сыворотки).

Формы 1а и 2а являются естественным иммунитетом, формы 16 и 26 - искусственным. По на­правленности приобретенный иммунитет (формы I а,б и 2а,б) может быть антитоксическим (защита от чужеродного яда) и антимикробным (невосприимчивость к микробам). В свою очередь анти­микробный иммунитет (по присутствию или отсутствию в организме живых микробов) делят на нестерильный (инфекционный) и стерильный.

Особым видом защиты является местный иммунитет, которому свойственны черты и естест­венной резистентности и приобретенного иммунитета.

Признаки естественной резистентности:

1. Наследуется, являясь видовым признаком.

2. Отличается относительной стойкостью в течение жизни.

3. Формирование не связано с поступлением антигена (чужеродных агентов).

4. Механизм защиты однотипен вне зависимости от вида возбудителя (неспецифичность защиты)

Признаки приобретенного иммунитета:

1. Приобретается в течение жизни индивидуума (не наследуется).

2. Нестоек во времени.

3. Строго специфичен (направлен против того возбудителя или яда, к которому иммунизиро­ван индивидуум).

РЕАКЦИИ ИММУНИТЕТА

Реакциями иммунитета (серологическими реакциями) называют действие между анти­генами и антителами, ведущее к образованию иммунного комплекса (антиген-антитело). Они про­текают, как правило, в 2 фазы в присутствии дополнительного фактора (электролит, комплемент, фагоцит или др.). Специфическая фаза (невидимая, "химическая") происходит очень быстро и ха­рактеризуется соединением детерминантной группы антигена с активным центром антитела, В ре­зультате образуется комплекс, утрачивающий растворимость в изотонических растворах например, в растворе хлорида натрия. Неспецифическая фаза (видимая, "коллоидная") наступает через не­сколько минут или часов и характеризуется укрупнением комплекса антиген+антитело с изменением его физических свойств. Эта фаза сопровождается видимыми феноменами: выпадением осад­ка, образованием хлопьев, просветлением взвеси, остановкой движения частиц и др.

Реакции иммунитета высокоспецифичны и их широко применяют на практике для серодиаг­ностики инфекций (по обнаружению антимикробных антител в сыворотке крови), определения ви­да и варианта микроба по антигенной структуре, определения других антигенов (аллергенов, гор­монов, биологических образцов разного происхождения). Области применения реакций иммунитета: диагностика инфекционных и неинфекционных заболеваний, фармация, санитарно-ветеринарная служба, трансплантация органов и тканей (в т.ч. крови), судебная медицина.

Реакция агглютинации(РА) - это взаимодействие корпускулярного антигена (взвеси бакте­рий, других клеток или частиц) и антител - агглютинов в изотоническом растворе с образованием и осаждением агглютината (хлопьев из склеившихся частиц).

Реакцию ставят несколькими методами. Быстрая ориентировочная РА ставится на предмет­ном стекле и учитывается в течение 2-3 мин после смешивания ингредиентов и покачивания стек­ла. Более надежные результаты даёт использование адсорбированных и монорецепторных сыворо­ток, что позволяет избежать неспецифических реакций, например, с родственными бактериями за счет общих антигенов. Развернутая (объёмная) РА более точна, она ставится в пробирках и учиты­вается через сутки. В ряду пробирок готовят последовательные двукратные разведения сыворотки в ИХН - 1:50, 1:100, 1:200, 1:400 и т.д. Затем в каждую пробирку добавляют одинаковое количест­во взвеси клеток, встряхивают и ставят при комнатной температуре. Результат учитывают по ха­рактеру осадка и просветлению надосадочной жидкости. Титром агглютинирующей сыворотки считают её максимальнее разведение, при котором наблюдается выраженная реакция. РА используют для идентификации микробов по антигенной структуре, для определения антимикроб­ных антител и их титра в сыворотке при серодиагностике инфекционных заболеваний, при опреде­лении группы крови и т.п.

Реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА) является разновидностью не­прямых агглютинационных реакций, наряду с реакцией коагглютинации, агглютинации латекса и др. Эти реакции более чувствительны, чем РА, т.к. предварительно стандартный антиген (или ан­титело) присоединяют к корпускулярному носителю - эритроцитам, убитым микробам или части­цам латекса, получая, соответственно, эритроцитарные, коагглютинирующие или латексные диагносгикумы (антигенные или иммуноглобулиновые). РПГА с антигенным эритроцитарным диагностгкумом ставят в пробирках или лунках планшета с двукратными разведениями сыворотки (например, с целью серодиагностики инфекций или выявления напряжённости иммунитета - по титру антител). При положительной реакции через 4-20 ч формируется рыхлый осадок эритроци­тов на всей площади дна пробирки или лунки - «зонтик». При отрицательной реакции эритроциты образуют плотный осадок в центре (в виде «пуговки»). РПГА с иммуноглобулиновыми диагности-кумами учитывают так же, но её ставят для быстрой индикаций возбудителя в исследуемом мате­риале или его идентификации по антигенной структуре. Это метод экспресс-диагностики.

Реакция преципитации (РП) - это выпадение в осадок растворимого антигена при взаимо­действии с сответствующими антителами-преципитинами в присутствии электролита. Антигеном может быть прозрачный раствор белка или гаптена, различные экстракты.

РП ставят несколькими методами. Метод кольцепреципитации: на диагностическую сыворот­ку с известными преципитинами в узкой пробирке сверху осторожно наслаивают раствор антигена и в течение часа учитывают положительную реакцию (на границе жидкостей образуется белый диск преципитата и постепенно оседает). Так определяют, например, антиген возбудителя сибир­ской язвы в разных материалах. Метод преципитации в капилляре: стеклянный капилляр диамет­ром I мм сначала опускают на 1/3 в диагностическую сыворотку, а затем на 1/3 - в раствор антиге­на, переворачивают несколько раз и оставляют в вертикальном положении на сутки. Зёрна преципитата оседают и собираются столбиками на нижнем мениске жидкости в капилляре. Так оп­ределяют, например, С-реактивный белок (СРБ) при аутоиммунных заболеваниях, ревматизме, ту­беркулёзе, инфаркте миокарда (диагностическую сыворотку с преципитинами к СРВ получают пу­тем иммунизации кроликов). Методы диффузной преципитации в агаровом геле: растворы антигенов и антител помещают в разные места прозрачного геля, из которых они диффундируют, образуя при встрече преципитат в виде белых полос или линий. В методе простой диффузии анти­ген диффундирует в агаре, содержащем определенную концентрацию диагностической сыворотки, которую предварительно вводили в не застывший агар. В методе двойной диффузии антигены и антитела из лунок в агаре диффундируют навстречу друг другу в нейтральном слое агара.

В методе иммуноэлектрофореза раствор неоднородного антигена сначала подвергают фрак­ционированию в агаровом геле под действием постоянного тока а затем канавку в теле, сделанную сбоку от линии распределения фракций заполняют сывороткой (антителами). В результате двой­ной диффузии в геле образуется специфический рисунок из дуг к линий преципитата, вид которого зависит от количества и качества фракций антигена и антител.

РП обладает высокой чувствительностью, она позволяет выявлять белковые антигены в раз­ведениях 1:100000 и выше, т.е. недоступных для обнаружения химическим путём. Титром преципитирующей сыворотки считают наибольшее разведение антигена, дающее преципитацию при контакте с ней. Такая особенность связана с мелкодисперсным состоянием антигена, малы­ми размерами его молекул. РП применяют для индикации микробных антигенов в материале от больных и из внешней среды, определения иммуноглобулинов разных классов (диагностика и профилактика инфекций и иммунодефицитов) для выявления фальсификации пищевых продуктов (санитарная практика), для определения видовой принадлежности крови и других биологических примесей (судебно-медицинская практика).

Реакция нейтрализации токсина антитоксином(РН) - серологическая реакция между мик­робным экзотоксином и антителами, приводящая к инактивации ядовитого действия токсина. Её ставят в опытах на животных: для обнаружения экзотоксина в исследуемом материале; для опре­деления титра антитоксина в иммунной сыворотке. Например, материал, содержащий экзотоксин, смешивают с известной диагностической сывороткой (в избытке), выдерживают 30 мин и вводят животным. Если сыворотка нейтрализует токсин, отравления и гибели животных нет. Если токсин не соответствует антитоксинам сыворотки, животные погибают (как и в контрольной группе жи­вотных, получивших тот же материал без сыворотки). В обычной лабораторной практике данную реакцию используют для диагностики ботулизма. Для определения антитоксической сыворотки ставят такой же опыт, но берут стандартный экзотоксин известной, силы и смешивают с сыворот­кой в разных соотношениях. Определяют наименьшее количество сыворотки, нейтрализующее оп­ределенное число минимальных летальных доз-DLM токсина (это количество соответствует I ан­титоксической единице, АЕ сыворотки). Титр сыворотки выражают количеством АЕ или ME (международных антитоксических единиц) в I мл сыворотки. Например, I ME противодифтерий­ной сыворотки нейтрализует 100 DLM дифтерийного токсина для морской свинки.

Титрование антитоксических сывороток проводят и в пробирках - в реакции флоккуляции (разновидность РП). Оно основано на том, что при смешивании экзотоксина или анатоксина (т.е. белкового антигена) с титруемой сывороткой наиболее раннее помутнение (инициальная флокку-ляция) наблюдается в пробирке с эквивалентным соотношением токсина (анатоксина) и антиток­сина (т.е. I TE (Lf) : I АЕ (МЕ)).

Реакция иммунофлюоресценции(ИФ) - взаимодействие люминесцирующих антител с кор­пускулярным антигеном и образование светящегося иммунного комплекса. Метод основан на спо­собности иммуноглобулинов прочно соединяться с флюорохромами (ФИТЦ, акридиновым оран­жевым и др.) без потери специфичности. Под действием ультрафиолета флюорохромы дают вторичную люминесценцию.

В прямом методе ИФ на предметном стекле готовят и фиксируют мазок из антигенсодержащего материала, наносят на него люминесцирующую сыворотку (например, противочумные анти­тела, меченные ФИТЦ). После 30-минутного контакта препарат тщательно промывают и изучают под люминесцентным микроскопом. Клетки чумного микроба в исследуемом материале светятся по периферии желто-зеленым цветом. ИФ протекает в I фазу и обладает рядом достоинств: высо­кочувствительна, проста в постановке, может использоваться как метод экспресс-диагностики (ответ в течение 1-2 ч). Её используют для быстрого обнаружения микробов в исследуемом материа­ле, а также для их идентификации.

Непрямой метод ИФ отличается тем, что на стекло наносят обычные кроличьи антитела, ко­торые образуют с клетками невидимый комплекс АГ+АТ. Затем препарат промывают и обрабаты­вают люминесцирующей: сывороткой с ослиными (лошадиными) AT к кроличьему белку (образу­ется двойной светящийся комплекс). Этот метод более экономичен, т.к. используется одна люминесцирующая и набор нелюминесцирующих сывороток.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Основан на использовании антител, меченных фермен­том, который проявляет в присутствии субстрата специфическую активность в случае образования комплекса антиген+антитело, фиксированного на твёрдой основе. ИФА широко используют для определения разнообразных антигенов и антител. Разработано много методов и модификаций ИФА, выпускаются коммерческие наборы. Для определения антигена в исследуемом материале (сэндвич-метод) вначале производят сорбцию известных антител на поверхности лунок полистиро­ловой пластины, затем вносят антигенсодержащий материал, и, после контакта, тщательно промывают. Затем в лунки добавляют соответствующие антитела (сыворотку), меченные пероксидазой хрена или другим ферментом, отмывают и добавляют хромогенный субстрат (5-аминосалициловую кислоту с перекисью водорода или др.).

При положительной реакции в течение 1 часа развивается коричневое окрашивание, интен­сивность которого зависит от количества меченных антител, связанных в иммунном комплексе. Для определения неизвестных антител (например, с целью серодиагностики сифилиса или ВИЧ-инфекции) на поверхности лунок сорбируют известный антиген, затем добавляют исследуемую сыворотку крови, промывают, вносят сыворотку с антителами против иммуноглобулинов челове­ка, меченную ферментом,и, после вторичной промывки, добавляет хромогенный субстрат. Учиты­вают так же. ИФА отличается высокой чувствительностью и специфичностью.

ИММУНОБЛОТТИНГ

Качественный метод, позволяющий выявлять антигены и антитела в исследуемой пробе.

Для выявления антител:

Исследуемую сыворотку больного инкубируют с известными антигенами нанесенными на нитроцеллюлозную мембрану, затем добавляют меченную диагностическую сыворотку против иммуноглобулинов человека.

Для выявления антигена:

С помощью электрофореза разделяют белки в исследуемой пробе от больного, затем их пере­носят на нитроцеллюлозную мембрану и добавляют меченную диагностическую сыворотку против известных антигенов

Иммуноблоттинг широко применяется для подтверждения твердофазного иммуноферментного анализа.

Классификация вакцин

Живые вакцины	Корпускулярные инактивированиые вакцины	Надмолекулярные вакцины	Молекулярные вакцины
Аттенуированные	Цельноклеточные	На основе протек- тивных антигенов (субъединичные и субклеточные)	Биосинтетические (ана­токсины)
Дивергентные	Цельновирионные	Химически- синтезированные антиге­ны
Векторные (рекомбинантные)	Генноинженерные

В настоящее время для профилактики инфекционных заболеваний применяют следующие вакцинные препараты:

1) Вакцины живые составляют примерно половину из всех применяемых в практике вакцин. Живые вакцины при введении в организм (обычно в дозе 1 тыс.-1 млн. клеток) приживаются, раз­множаются, вызывают вакцинальный процесс и формирование активного иммунитета против со­ответствующего возбудителя. Вакцины получают из аттенуированных вакцинных штаммов или из непатогенных для человека природных (дивергентных) штаммов, имеющих общие антигенные свойства с болезнетворными патогенными штаммами представляют собой взвеси выращенных на различных питательных субстратах вакцинных штаммов. Основным свойством живого аттенуированного штамма, используемого в производстве вакцин, является стойкая утрата вирулентности при сохранении способности вызывать иммунную реакцию, схожую с естественной. Вакцинный штамм размножается в организме хозяина и индуцирует клеточный, гуморальный, секреторный иммунитет, создавая защиту всех входных ворот инфекции. Главными преимуществами живых вакцин являются:

— высокая напряженность, прочность и длительность создаваемого ими иммунитета;

— возможность применения не только путем подкожного введения, но и другими, более про­стыми путями (накожно, перорально, интраназально).

Живые вакцины имеют ряд недостатков:

— сложно комбинируются и плохо дозируются;

— категорически противопоказаны людям, страдающим иммунодефицитом;

— вызывают вакцинно-ассоциированные заболевания

— относительно нестабильны;

— естественно циркулирующий дикий вирус может тормозить репликацию вакцинного виру­са и снизить эффективность вакцины; это отмечалось в отношении вакцинных штаммов полиовируса, размножение которого может подавляться при инфицировании другими энтеровирусами.

В процессе производства, транспортировки, хранения и применения живых вакцин, на­ходимо строго соблюдать меры, предохраняющие микроорганизмы от гибели и гарантирующие сохранение активности препаратов (холодовая цепь).

В Российской Федерации живые вакцины широко применяют с целью специфической профи­лактики полиомиелита, кори, эпидемического паротита, гриппа, туберкулеза, чумы, туляремии, бруцеллеза, сибирской язвы.

2) Убитые вакцины (инактивированные) получают путем получаемые путем инактивации выращенных штаммов различными методами таким способом, который приводит лишь к минимальному повреждению структурных белков. Чаще всего с этой целью прибегают к мягкой обра­ботке формалином, фенолом, спиртом. Инактивируют нагреванием при температуре 56 С в тече­ние 2-х часов, УФ-лучами. Иммуногенность инактивированных вакцин ниже в сравнении с живыми, иммунитет менее напряженный и непродолжительный.

Убитые вакцины имеют следующие преимущества:

1) хорошо комбинируются, дозируются;

2) не вызывают вакцинно-ассоциированных заболеваний

3) применяются у людей, страдающих иммунодефицитами

В Российской Федерации применяют убитые вакцины (против брюшного тифа, холеры, бешенства, гриппа, клещевого энцефалита, лентосиироза, коклюша.

Лечебные убитые вакцины против бруцеллеза, дизентерии, гонореи, стафилококковых инфекций. Лечебный эффект достигается за счет активации работы иммунной системы и факторов естественной резистентности организма. Лечебные убитые вакцины применяют при хронических, вялотекущих инфекциях; вводят в/мышечно, дозировано под контролем состояния больного.

К недостаткам корпускулярных вакцин (живых и убитых) следует отнести наличие в их составе большого количества «балластных» АГ и других компонентов, не участвующих в формиро­вании специфической защиты; они способны оказывать токсическое и/или аллергизируюшее влияние на организм.

3) Химические вакцины содержат отдельные компоненты (обладающие иммуногенностью) извлекаемые из микроорганизмов различными химическими методами Химические вакцины имеют следующие преимущества:

— менее реактогенны, пригодны для детей дошкольного возраста

Химические вакцины имеют ряд недостатков:

— иммуногенность химические вакцин ниже в сравнении с живыми, поэтому часто в такие препараты добавляют адъювант (гидрат окиси алюминия).

В Российской Федерации применяют вакцины для профилактики брюшного и сыпного тифов, менингококковую, гриппозную и др.

4) Анатоксины, анатоксины, получают путем обезвреживания формалином токсинов, являющихся продуктом