Определение алкоголя в выдыхаемом воздухе
В выдыхаемый воздух алкоголь проникает из крови, диффундируя через стенки альвеол. Соотношение концентрации алкоголя в крови и альвеолярном воздухе постоянно, оно определяется разностью плотности сред: крови и воздуха и составляет в среднем 1: 2200 при колебаниях от 1300 до 3000. Это означает, что в 2200 см3 альвеолярного воздуха содержится такое же количество алкоголя, как и в 1 см3 крови.
Содержание паров алкоголя в выдыхаемом воздухе выражается в миллиграммах на 1 м3 (мг/м3) и с учетом отношения плотностей крови и воздуха может быть ориентировочно выражено в промиллях по крови. При этом 0,1 град./00 алкоголя в крови соответствует примерно 45 мг/м3 алкоголя в выдыхаемом воздухе.
Как правило, в выдыхаемом воздухе в небольших количествах может находиться ряд органических, так называемых редуцирующих веществ, таких как ацетон, альдегиды и др., которые также, как и алкоголь могут влиять на результаты исследования при применении неизбирательных к алкоголю методов.
Следует отметить, что при исследовании выдыхаемого воздуха на алкоголь нередко допускаются ошибки. Чаще всего они обусловлены неточным выполнением методики исследования. Кроме того, имеются по крайней мере два обстоятельства, влияющие на результат исследования. Во-первых, иногда ошибочный результат исследования может быть получен за счет небольших количеств алкоголя, адсорбировавшегося на слизистой оболочке ротоглотки при употреблении накануне исследования спиртосодержащих лекарств. Это так называемый фиксированный алкоголь. При употреблении небольших количеств, например 20 капель спиртовой настойки валерианы, алкоголь адсорбируется на слизистой оболочке ротовой полости и глотки и выделяется с выдыхаемым воздухом в течение 10 - 20 минут в значительной концентрации.
Во-вторых, ошибка может быть обусловлена наличием в полости рта либо в окружающей среде примесей редуцирующих веществ. Например, наличие в окружающем воздухе в значительных концентрациях ацетона, бензина, выхлопных газов и других летучих веществ приводит к их вдыханию обследуемым с последующим введением с выдыхаемым воздухом в реакционную камеру приборов и искажению результатов исследования. В течение 4 - 5 минут после курения на результаты исследования могут оказывать влияние выделяющиеся из дыхательных путей соединения углерода.
В целях недопущения ошибок, вызываемых изложенными выше причинами, следует соблюдать следующие правила:
· помещение перед проведением исследования должно быть хорошо проветрено; проведение исследования не допускается при наличии запахов спирта, эфира, бензина, ацетона, одеколона и других летучих горючих веществ от одежды, рук, лица обследуемого; до начала исследования запахи должны быть устранены (наличие летучих горючих веществ в окружающей атмосфере может быть оценено с помощью тех же методов и устройств, которые применяются для анализа выдыхаемого воздуха); · перед тем, как приступить к проведению пробы, обследуемого предупреждают об этом и спрашивают его, о чем бы он хотел сообщить в связи с проведением медицинского освидетельствования; такая постановка вопроса позволяет получить более точные сведения об употреблении накануне спиртных напитков или спиртосодержащих лекарств, прямые же вопросы о приеме накануне обследования спиртосодержащих жидкостей нередко наталкивают испытуемого на неверные ответы; · проба проводится не ранее, чем спустя 15 - 20 минут после употребления спиртных напитков, приема спиртосодержащих лекарств, полоскания рта дезодорантами.2.1.3. Химические способы определения алкоголя в выдыхаемом воздухе Проба Рапопорта А.М.
Наиболее простым и доступным для применения в любом медицинском учреждении способом является проба Рапопорта.
В две чистые сухие пробирки наливают по 2 мл дистилированной воды. В одну из них опускают пипетку с узким вытянутым концом, и испытуемый пропускает через нее 1,9 - 2,1 л выдыхаемого воздуха. Объем воздуха может дозироваться продолжительностью выдоха или с помощью дозирующего устройства. В первом случае для продувания воздуха используют пипетку типа пастеровской, и воздух продувают в течение 20 - 30 секунд.
Проходя через воду, алкоголь, содержащийся в выдыхаемом воздухе, растворяется в ней, и затем наличие его определяют с помощью следующей химической реакции.
В обе пробирки приливают осторожно по 20 капель химически чистой концентрированной серной кислоты и после этого по 1 капле 0,5% свежеприготовленного раствора марганцовокислого калия. Необходимо тщательное выполнение технологии проведения пробы: соблюдение последовательности операций, использование свежеприготовленных дистиллированной воды и 0,5% раствора перманганата калия, чисто вымытых и высушенных пробирок и пипеток, шлангов, проведение реакции в контрольной пробирке.
Внимание! Соблюдение описанной последовательности действий обязательно. Недопустимо продувание выдыхаемого воздуха через раствор, содержащий серную кислоту, т.к. в этих случаях возможно попадание кислоты в дыхательные пути.
Результаты исследования оцениваются в течение 1 - 2 минут с момента введения в пробирку раствора марганцовокислого калия. Если в течение 2 минут раствор в сравнении с контрольным не изменил цвета - экзогенного алкоголя в организме обследуемого нет, испытуемый на момент исследования под воздействием алкоголя не находится.
При полном или частичном обесцвечивании раствора пробу через 15 - 20 минут проводят повторно. Полное обесцвечивание раствора за 1 - 2 минуты при повторной пробе свидетельствует о наличии экзогенного алкоголя в выдыхаемом воздухе, что при точном соблюдении методики исследования может подтверждать факт потребления испытуемым спиртных напитков.
Если при повторной пробе полного обесцвечивания раствора в течение 2 минут не наступило, результаты пробы расцениваются как отрицательные.
Изменение цвета раствора в контрольной пробирке свидетельствует о нарушении условий проведения пробы (загрязненная посуда, некачественные реагенты) и опровергает результаты исследования.
2.1.4. Индикаторные трубки Мохова - Шинкаренко и "Контроль трезвости"
Эти трубки имеют сухую индикаторную набивку (реагент), что исключает необходимость в проведении каких-либо манипуляций с реактивами в момент экспертизы. Реагент индикаторных трубок состоит из носителя (Силикагеля), импрегнированного раствором хромового ангидрида в концентрированной серной кислоте. При воздействии на реагент парами этилового спирта происходит реакция, во время которой пары этилового спирта восстанавливают ионы 6-тивалентного хрома до ионов 3-х валентного хрома, в связи с чем оранжевый или желтый цвет реагента изменяются на зеленый, что оценивается как положительная реакция.
Несмотря на некоторую неспецифичность метода, все же индикаторные трубки выгодно отличаются от других проб тем, что при воздействии на реагент парами некоторых веществ, лекарств и ядов отсутствует положительная реакция реагента, в то время как она имеет место в других пробах. Реагент изменяет цвет на зеленый при воздействии паров следующих веществ: этилового и метилового спиртов, эфиров, ацетона, альдегидов, сероводорода. При воздействии бензина, скипидара, уксусной кислоты, камфары, а также фенола, дихлорэтана реагент приобретает темно - коричневую или коричневую окраску. При воздействии паров валидола, ментола, воды, хлороформа, хлорангидрата, керосина, аммиака, щелочи, этиленгликоля, окиси углерода, чистого выдыхаемого воздуха и слюны цвет реагента - оранжевый.
Правила пользования индикаторными трубками, каждая из которых рассчитана только для однократного употребления, предусматривают несколько манипуляций. Перед употреблением на герметичной индикаторной трубке делаются напильником два надреза: один вблизи заплавленного широкого конца трубки, а другой вблизи вершины конусообразной наплавки.
После этого оба конца трубки отламываются. Трубку предлагают взять обследуемому в рот со стороны широкого конца и интенсивно непрерывно продувать воздух в направлении реагента в течение 20 - 25 минут. Этого времени вполне достаточно для обнаружения присутствия паров спирта. При слабом продувании выдыхаемого воздуха, содержащего пары алкоголя, оранжевая окраска индикатора может измениться в зеленый цвет не полностью, а частично. Однако и в этом случае реакция окажется положительной. Контроль за интенсивностью струи продуваемого воздуха осуществляется путем надувания емкости, или наблюдения за отклонением пламени горящей спички, подносимой к периферическому суженному концу трубки. При отсутствии спички рекомендуется направить трубку на увлаженную поверхность тыльной стороны кисти и об интенсивности струи продуваемого воздуха судить по ощущению охлаждения.
Трубка Мохова - Шинкаренко обладает большим сопротивлением, что затрудняет ее продувание. Облегчить процедуру отбора проб и контролировать достаточное продувание реагента выдыхаемым воздухом можно с помощью несложного приспособления. Между обследуемым и трубкой Мохова - Шинкаренко с помощью трехходовой трубки устанавливается полиэтиленовый мешок емкостью 650 - 750 куб. см., а на периферический суженный конец индикаторной трубки - полиэтиленовый мешок емкостью 120 - 130 куб. см. Обследуемому дается команда дуть в мундштук до полного заполнения обоих мешков. При выполнении пробы воздух "вредного" пространства дыхательных путей за счет высокого сопротивления трубки Мохова - Шинкаренко первоначально заполняет мешок емкостью 650 - 750 см3 находящийся перед трубкой, а затем альвеолярный воздух проходит реагент и наполняет мешок емкостью 120 - 130 куб. см., находящийся на выходе из трубки.
Благодаря такому приспособлению на реагент поступает только альвеолярный воздух, которого для проведения пробы необходимо в несколько раз меньше, чем воздуха, смешанного с воздухом "вредного" пространства.
Ввиду гигроскопичности индикатора трубки вскрываются непосредственно перед употреблением. По этой же причине индикаторные трубки рассчитаны только для однократного употребления даже при наличии отрицательной реакции.
Индикаторные трубки, имеющие нарушение герметизации, а также изменившие окраску реагента на зеленый цвет, употреблению не подлежат.
Термокаталитический метод
Метод основан на сорбировании паров алкоголя выдыхаемого воздуха с последующей термодесорбцией и сжиганием на элементах чувствительного детектора. Этот принцип реализуется с помощью прибора для определения паров спирта в выдыхаемом воздухе - ППС-1.
Конструкция прибора обеспечивает подогревание выдыхаемого воздуха и отбор для анализа пробы именно альвеолярного воздуха. Калибровка прибора производится с помощью генератора контрольных смесей ГС-1, производящего пароспиртовоздушные смеси с определенным содержанием в них алкоголя.
Прибор ППС-1 более чувствителен и точен в сравнении с качественными реакциями.
Инструкция по медицинскому применению прибора ППС-1 с описанием порядка работы и указанием критериев выявления паров алкоголя в выдыхаемом воздухе входит в комплект прибора.
Следует отметить, что термокаталитический метод, реализуемый с помощью прибора ППС-1, также, как и качественные пробы на алкоголь (Рапопорта, трубки Мохова - Шинкаренко и "Контроль трезвости"), неизбирателен по отношению к этиловому спирту. Указанные способы дают положительные результаты и при наличии в выдыхаемом воздухе ряда других летучих веществ, например, ацетона, эфиров, метанола. В связи с этим в практике экспертизы алкогольного опьянения перечисленные методы используются как предварительные пробы. Доказательное значение имеет лишь отрицательный результат качественных проб и исследований с помощью прибора ППС-1 или сочетание положительных реакций с клинической картиной опьянения. В ряде случаев у освидетельствуемого необходимо собирать на исследование жидкие биологические среды (мочу, слюну либо кровь) для проведения количественного определения алкоголя в них предпочтительно методом газовой хроматографии.
2.1.6. Методы количественного определения алкоголя в жидких биологических средах
Из жидких биологических сред при освидетельствовании для установления факта употребления алкоголя и алкогольного опьянения наиболее часто исследуются моча и слюна. Кровь для определения алкоголя может забираться только при наличии соответствующих медицинских показаний.
Оценивая результаты исследований, следует иметь в виду, что даже при одновременном отборе проб различных биологических жидкостей количество алкоголя в них может быть неодинаковым. Это обусловлено рядом причин:
- во-первых, плотностью среды, количеством в ней воды. В связи с гидрофильностью алкоголя, при равных условиях в среде с большим содержанием воды больше и алкоголя. Например, если определить концентрацию алкоголя в цельной крови, плазме и эритроцитарной массе из одной и той же пробы крови, то, соответственно, наибольшее количество алкоголя будет определено в плазме, меньшее в цельной крови и еще меньшее в эритроцитарной массе; - во-вторых, имеет значение фаза опьянения. В фазе резорбции наибольшая концентрация алкоголя определяется в артериальной крови. В этой фазе алкоголь проникает из артериальной крови в ткани, и в венозной крови, оттекающей от тканой, его концентрация ниже. В фазе резорбции артериовенозная разница по алкоголю может достигать 0,6 град./оо. Что касается мочи, то ее проба из мочеточников содержит алкоголя столько же, сколько и омывающая почки кровь. Поскольку на практике для пробы отбирается пузырная моча, то концентрация алкоголя в ней зависит от времени отбора пробы и времени, предшествующего опорожнению пузыря, т.к. в пузыре идет постоянное смешивание порций мочи, поступающей в различные фазы опьянения. Тем не менее определенно известно, что в фазе резорбции концентрация алкоголя в пузырной моче всегда ниже, чем в крови. В фазе элиминации содержание алкоголя в моче может быть выше, чем в крови. И, наконец, после опьянения, когда в крови экзогенный алкоголь уже не обнаруживается, он все еще может определяться в моче.Содержание эндогенного алкоголя в крови, согласно литературным данным, находится в пределах 0,008 - 0,4 град./оо. Результаты определения эндогенного алкоголя зависят прежде всего от применяемого метода. При не избирательных к алкоголю способах, обладающих большой погрешностью измерения, например способе Видмарка, Никлу, фотоколориметрическом, максимальными уровнями эндогенного алкоголя в биологических жидкостях принято считать 0,3 - 0,4 град./оо. При газохроматографическом исследовании в биологических жидкостях в зависимости от методики исследования эндогенного алкоголя определяют не более 0,02 - 0,07 град./оо.
Результаты исследования во многом зависят от точности соблюдения методики пробоотбора биологической жидкости, условий хранения пробы и транспортировки, погрешности метода, ошибок при проведении исследований. С учетом сказанного обнаружение алкоголя в биологической жидкости в концентрации ниже 0,3 град./оо не может достоверно свидетельствовать о факте употребления алкоголя.
Забор биологических сред у лиц, освидетельствуемых для установления состояния алкогольного опьянения, должен проводиться в любое время суток.
Взятие крови и мочи у лиц, подозреваемых или обвиняемых в совершении правонарушений, а также у потерпевших производится в порядке, установленном ст. ст. 141 и 186 УПК РСФСР и соответствующими статьями союзных республик.
Моча отбирается в сухой стерильный флакон из-под пенициллина "под пробку". Флакон тотчас же закрывают пробкой. Отбор пробы мочи должен производиться в условиях, исключающих подмену или замену ее другими жидкостями.
Слюна отбирается в стерильный сухой флакон из-под пенициллина в количестве 5 мл и тут же закрывается пробкой.
У всех флаконов с отобранными пробами фиксируют пробки алюминиевыми колпачками с помощью приспособления для обжима колпачков (ПОК-1), обеспечивающего герметизацию флакона, и ставят их в холодильник. В случае герметизации другим способом флаконы должны быть опечатаны. На каждый флакон наклеивается этикетка с указанием номера пробы (по регистрационной книге), даты, времени забора пробы, фамилии освидетельствуемого, фамилии медицинского работника, подготовившего пробу.
Перед отбором пробы крови в сухой стерильный флакон из-под пенициллина закапывают 1 - 2 капли гепарина или 0,8 мл 3,8%-го раствора цитрата натрия и встряхиванием флакона смачивают его стенки.
Кровь в количестве 5 мл отбирается пункцией кубитальной воды при строгом соблюдении асептических условий самотеком во флакон, обработанный гепарином или цитратом. Флакон тотчас же закрывают стандартной резиновой пробкой, фиксируют пробку и содержимое флакона перемешивают. Кожа в месте пункции предварительно обрабатывается раствором сулемы 1 : 1000 или риванолом 1 : 500. Дезинфекция кожи спиртом, эфиром, настойкой йода или бензином не допускается.
Данные о взятии мочи, слюны или крови заносятся в журнал регистрации анализов и их результатов (форма N 250/у, утвержденная Приказом Минздрава СССР от 04.10.80 N 1030). При этом указываются: порядковый номер, дата и время взятия мочи, крови или слюны; фамилия, имя, отчество врача, производившего взятие пробы крови (откуда взята кровь и способы обработки кожи), количество взятых биосред, дата и время передачи биосред на анализ, дата проведения исследования, результаты исследования. Листы регистрационного журнала должны быть пронумерованы, прошнурованы и скреплены сургучной печатью учреждения.
Пробы биологических сред следует хранить в холодильнике при температуре не ниже -4 град. С.
В лабораторию пробы мочи, крови и слюны передаются с направлением, в котором указаны порядковый номер пробы (по регистрационной книге), наименование, количество, дата и время взятия биосред, условия хранения, цель анализа, Ф.И.О. направившего врача, адрес направившего учреждения.
Биосреды, как правило, должны исследоваться не позднее суток с момента их отбора. Допускается их хранение до исследования в холодильнике при температуре не ниже -4 град. С в течение 5 суток. При длительном хранении биосред с нарушением температурного режима хранения в них развиваются бродильные и гнилостные процессы, которые могут существенно исказить результаты количественного определения.
Часть исследуемой среды (из флакона) используют для определения этилового алкоголя, оставшуюся часть хранят в холодильнике для возможных контрольных исследований в течение 35 дней.
Склянки (пробирки), предназначенные для взятия крови и мочи, моются 2%-ным раствором соды, ополаскиваются дистиллированной водой и стерилизуются обычным способом.
В настоящее время для количественного определения алкоголя в биологических жидкостях в нашей стране используются методы фотоколориметрии и газожидкостной хроматографии.
Первый из них недостаточно избирателен к алкоголю, обладает значительными погрешностями, однако до сих пор используется в отдельных лечебных учреждениях в тех случаях, когда не представляется возможным анализ более избирательным и точным способом.
В кабинете медицинского освидетельствования для установления факта употребления алкоголя и состояния опьянения количественное определение алкоголя в биологических жидкостях должно производиться методом газовой хроматографии. Этот метод обладает высокой специфичностью и точностью.
Газовая хроматография
Среди известных хроматографических методик для определения алкоголя в биологических жидкостях к настоящему времени Минздравом рекомендованы к использованию две модификации нитритного метода Сущность нитритного метода заключается в превращении спиртов в алкилнитриты, более летучие, чем спирты, и в дальнейшем хроматографировании алкилнитритов. Разделенные на хроматографической колонке компоненты смеси последовательно поступают в детектор по теплопроводности - катарометр, сигналы которого регистрируются в виде ряда хроматографических пиков на хроматограмме. Идентификация веществ производится по времени их удержания, которое исчисляется от момента введения анализируемого вещества в колонку до появления максимума пика. Чувствительность для этилового спирта составляет 0,01%. Расчет концентрации этилового алкоголя производят после калибровки по методу внутреннего стандарта. Внутренним стандартом служит изопропиловый спирт.
Для работы могут быть использованы отечественные газовые хроматографы ЛХМ-8МД, ЛХМ-80, "Цвет-100", 102, 106, 162 и другие, комплексованные детектором по теплопроводности (катарометром).
2.1.8. Методика определения этилового спирта *
Газовый хроматограф с детектором по теплопроводности. Газ - носитель: гелий, скорость потока: 24 мл/мин. Колонка металлическая, диаметром 3 мм и длиной 2 м, температура колонки 60 град. С. Твердый носитель (ТН) - целит С-22, фракция 60 - 80 меш, модифицированный металлическим серебром. Неподвижная фаза (НФ) - полиэтиленгликоль - 1500. Соотношение НФ к ТН - 1 : 10.
Примечание. В приборах с раздельными термостатами детектора и колонок температура термостата детектора - 100 град. С.
Подготовка твердого носителя
В качестве твердого носителя можно использовать любые вещества на основе кизельгура (целиты, хромосорб, хромотон, цветохром и т.п.) с размером частиц 0,16 - 0,20 мм, предварительно модифицированные слоем металлического серебра.
Модификация металлическим серебром проводится в следующем порядке: 0,2 г нитрата серебра растворяют в 3 - 4 каплях воды и добавляют 25 мл этанола. Раствор переносят к круглодонную колбу со шлифом и к раствору добавляют 10 г твердого носителя. Колбу присоединяют к вакуумному насосу на 25 - 30 мин. Затем колбу помещают на водяную баню (80 - 90 град. С) и отгоняют 10 - 15 мл спирта. Колбу снимают с бани и отсоединяют от вакуумного насоса. При постоянном перемешивании в колбу вносят 5 мл 10%-ного раствора аммиака. Колбу присоединяют на 15 - 20 мин. к вакуумному насосу. После отключения насоса в колбу вносят 3 мл раствора формальдегида, перемешивают и помещают на 5 мин. в водяную баню при постоянном перемешивании. Затем твердый носитель промывают декантацией горячей дистиллированной водой и переносят на сито. Твердый носитель на сите промывают водой до нейтральной реакции, затем свежеприготовленным 1%-ным раствором едкого калия, и раствору дают свободно стечь. После этого твердый носитель сушат при 90 - 95 град. С досуха, а затем прокаливают 3 часа при 160 - 180 град. С.
Приготовленный твердый носитель сохраняют в склянках с притертой пробкой.
Примечание.Перемешивание твердого носителя осуществляется только (!) вращением колбы, применение стеклянных палочек или мешалок недопустимо.
Нанесение неподвижной фазы
В выпаривательной чашке растворяют 1 г неподвижной фазы в 20 мл перегнанного хлороформа и в раствор вносят 10 г подготовленного твердого носителя. Содержимое перемешивают покачиванием в течение 8 - 10 мин. и чашку помещают на водяную баню с температурой 60 - 65 град. С при постоянном перемешивании до полного удаления растворителя и отсутствия запаха хлороформа.
Подготовку твердого носителя и нанесение неподвижной фазы можно производить на ротационном испарителе.