Аминокислоты, придающие белкам основный характер

1) цистеин и метионин

2) аргинин и лизин

3) триптофан и фенилаланин

4) лейцин и изолейцин

5) глицин и аланин

2. АТОМЫ ОСТОВА ПОЛИПЕПТИДНОЙ ЦЕПИ РАСПОЛАГАЮТСЯ В ПОРЯДКЕ

1) C-N-N-C

2) С-С-С-N

3) С-С-N-С

4) С-О-С-N

Выберите несколько ответов

3.РЕАГЕНТЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ N-КОНЦЕВОЙ АМИНОКИСЛОТЫ

1)гидразин

2)динитрофторбензол

3) карбоксипептидаза

4) фенилизотиоцианат

5) восстанавливающие агенты (NаВН₄)

Реагенты позволяющие определить С-концевую аминокислоту -

1) гидразин

2) динитрофторбензол

3) карбоксипептидаза

4) фенилизотиоцианат

5) дансилхлорид

Ответы к заданиям

1. – 2) 2. –3) (a-углеродный атом ®карбонильный углерод®амидный азот®a-углеродный атом) 3. –2),4); 4.-1), 3)

Обучающие задачи

Задача 1.Будет ли одинаковой интенсивность окраски, полученной в реакции с биуретовым реактивом, для растворов альбумина (Mr 64000 D) и иммуноглобулина G (Mr 175000D)одинаковой молярной концентрации? В чем заключается принцип биуретовой реакции?

Ответ.С биуретовым реактивом реагируют пептидные группы белков – образуется хелатный комплекс фиолетового цвета. Изменение окраски раствора при использовании биуретового реактива пропорционально не столько концентрации белка как таковой, сколько количеству пептидных связей. По сравнению с иммуноглобулинами, альбумин содержит меньше остатков аминокислот, так как имеет меньшую молекулярную массу, следовательно, интенсивность окраски раствора альбумина будет меньше при одинаковой молярной массе белков.

Задача 2.В ходе разделения смеси аминокислот хроматографическим методом подавляющее большинство протеиногенных аминокислот дают сине-фиолетовое окрашивание с нингидрином, а пролин и оксипролин – желтое. Объясните это различие, принимая во внимание особенности структуры протеиногенных аминокислот.

Ответ.При нагревании в щелочной среде нингидрина с веществами, имеющими первичные аминогруппы (—NH₂), образуется продукт, который имеет устойчивую интенсивную сине-фиолетовую окраску с максимальным поглощением около 570 нм. Нингидриновая реакция также используется для определения вторичных аминогрупп (>NH) в иминокислотах — пролине и оксипролине; в этом случае образуется продукт ярко-жёлтого цвета. Пролин и оксипролин являются иминокислотами, имеющими циклическую структуру, что влияет на структуру окрашенного комплекса с нингидрином и его светопоглощение.

оксипролин

При подготовке к занятию следует изучить обратимые и необратимые методы осаждения белков, их физико-химические свойства согласно таблице 2 и рисунку 3.

Таблица 2.Физико-химические свойства белков.

Задание	Указания к выполнению задания
1.Изучите суть явления растворимости и осаждаемости белков.	1. Какие физико-химические свойства белков обусловливают их растворимость? Чем обусловлена различная растворимость глобулярных и фибриллярных белков? Перечислите факторы, определяющие растворимость белков. 2. Приведите два основных фактора стабилизации белка в растворе. 4. В чем суть явления высаливания? 5. Приведите примеры практического использования высаливания. 6. Дайте определение явлению денатурации. Приведите классификацию видов денатурации. 7. Приведите примеры практического использования денатурации белков.
2.Изучите явление появления заряда у белковых молекул.	1.Выпишите два основных фактора, определяющих заряд белковой молекулы. 2.Напишите, что называется изоэлектрической точкой. Каковы свойства белков в изоэлектрическом состоянии? В какой среде будет находиться изоэлектрическая точка альбуминов и гистонов?

БЕЛОК В РАСТВОРЕ СТАБИЛИЗИРУЮТ 2 ФАКТОРА – ЗАРЯД И ГИДРАТНАЯ ОБОЛОЧКА

ВЫСАЛИВАНИЕ

ДЕНАТУРАЦИЯ

МЕТОДЫ ОСАЖДЕНИЯ

ДЕГИДРАТАЦИЯ И НЕЙТРАЛИЗАЦИЯ ЗАРЯДА БЕЛКОВЫХ ЧАСТИЦ

НАРУШЕНИЕ ВТОРИЧНОЙ, ТРЕТИЧНОЙ И ЧЕТВЕРТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ

БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ УТРАЧИВАЕТСЯ

БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ СОХРАНЯЕТСЯ

Рисунок 3. Схема «Методы осаждения белка»

Задания для самоконтроля

Выберите один наиболее правильный ответ.

1. ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКАЯ ТОЧКА ПЕПТИДА ГЛИ-АЛА-ВАЛ НАХОДИТСЯ В ЗОНЕ рН

1) нейтральной

2) слабокислой

3) щелочной

2 В ЩЕЛОЧНОЙ СРЕДЕ (рН 10) ДАННЫЙ ПЕПТИД БУДЕТ ДВИГАТЬСЯ К

а) аноду

б) катоду

3. ПРЕРЫВАЕТ a-СПИРАЛИЗАЦИЮ ПОЛИПЕПТИДНОЙ ЦЕПИ

1) тирозин

2) триптофан

3) валин

4) пролин

5) аспарагин

4.НА ПОВЕРХНОСТИ ГЛОБУЛЯРНОГО БЕЛКА, РАСТВОРИМОГО В ВОДЕ, НАИМЕНЕЕ ВЕРОЯТНО РАСПОЛОЖЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ

1) арг, глу

2) лиз, асп

3) вал, лей

5.НАКАПЛИВАЮЩИЙСЯ В ТКАНИ МОЗГА ПРИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦМЕЙГЕРА β-АМИЛОИД ПРЕДСТАВЛЯЕТ СОБОЙ

1)продукт экспрессии мутантного гена

2)нормальный белок с измененной конформацией

3) глобулярный белок с высоким содержанием α-структур

4) нерастворимые фибриллы с β-складчатой структурой

6.НАИБОЛЕЕ ОПТИМАЛЬНЫЙ МЕТОД ОСАЖДЕНИЯ БЕЛКА С ЦЕЛЬЮ ДАЛЬНЕЙШЕГО ИСПОЛЬОВАНИЯ ЕГО БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

1)осаждение органическими кислотами

2)осаждение гуанидинхлоридом

3)осаждение солями тяжелых металлов

4)высаливание

5)обработка парахлормеркурибензоатом или йодацетатом

7. ПРИ РАЗДЕЛЕНИИ БЕЛКОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ ВЫСАЛИВАНИЕМ ОЧИСТИТЬ ИХ ОТ СУЛЬФАТА АММОНИЯ ПОЗВОЛЯЕТ

1) хроматография

2) спектроскопия

3) высушивание при 100⁰С

4) диализ

5)рефрактометрия

8.ПРИОНОВЫЕ БЕЛКИ

1)способствуют поддержанию нативной конформации белка

2)нарушают нативную конформацию белка, приводя к образованию функционально неактивных агрегатов

3)легко гидролизуются протеолитическими ферментами

4)устойчивы к действию протеаз

5)участвуют в фолдинге белков

Ответы к заданиям

1. –2); 2.– 1)

3. –4) (включение пролина вызывает изгиб полипептидной цепи, делая невозможным вращение вокруг связи между a-углеродным атомом и азотом иминогруппы);

4.– 3) (гидрофобные радикалы прячутся внутри частицы белка);

5. – 4);

6. -4)

7. -4)

Примеры обучающих задач

Задача 1.Сделайте предположение об аминокислотном составе впервые выделенного пептида, принимая во внимание следующие экспериментальные данные:

-пептид не обладает электрофоретической подвижностью в щелочной среде (рН 9,8);

-при электрофорезе в кислой среде (рН5,6) движется к катоду;

-не дает окрашивания при обработке концентрированной азотной кислотой (ксантопротеиновая проба отрицательна).

Задача 2.Многие патологические состояния могут сопровождаться изменением рН мочи. Например, для цистита характерна щелочная реакция мочи. Объясните, почему при анализе мочи на содержание белка, в частности при осаждении белков кипячением, необходимо контролировать рН и, если необходимо, доводить его до слабокислой реакции?

Задача 3.Белок, синтезируемый invivo, принимает биологически активную конформацию. В то же время, при синтезе белка invitro не всегда удается получить функционально активный белок, даже при отсутствии сбоев, ошибок в первичной структуре. Объясните этот феномен.

Эталоны ответов на задачи

Задача 1.Аминокислотный состав пептида отличается высоким содержанием диаминомонокарбоновых кислот – лизина и аргинина, в то же время, в структуре пептида отсутствуют ароматические и гетероциклические аминокислоты - фенилаланин, тирозин, гистидин и триптофан, дающие положительную ксантопротеиновую реакцию. В частности, тирозин с концентрированной азотной кислотой реагирует по следующей схеме:

желтая окраска

оранжевая окраска

Задача 2.В сильнокислой и щелочной среде осаждению белков препятствует заряд (отрицательный в кислой и положительный в щелочной). Поэтому, если рН исследуемой мочи не соответствует слабокислой реакции, можно получить ложно отрицательный результат.

Задача 3.В живой клетке процесс укладки синтезируемой полипептидной цепи - фолдинг регулируется особыми белками шаперонами. Эти белки контролируют формирование стабильной и биологически активной конформации, предотвращая образование из полипептидной цепи неспецифических клубков и агрегатов, а также участвуют в доставке белков к субклеточным мишеням.

Необходимо изучить обратимые и необратимые методы осаждения белков, их амфотерные и электрические свойства. Для успешного усвоения материала при подготовке к занятию, пользуясь учебником и лекциями и по биохимии, дополнительной литературой, выполните следующие задания (таблице 3 и рисунка 4).

Таблица 3. Методы выделения индивидуальных белков.

Задание	Указания к выполнению задания
Вспомните методы выделения индивидуальных белков.	1. Перечислите методы фракционирования белков, позволяющие получить индивидуальный белок.
Изучите, почему белки обладают свойствами коллоидов.	1.Выпишите способы определения молекулярной массы белков. 2.Охарактеризуйте принцип метода диализа. Какое практическое значение имеет диализ?
Вспомните электрические свойства белков.	1. Охарактеризуйте явление электрофореза белков. 2. Напишите, на какие фракции разделяют белки сыворотки крови при электрофорезе на бумаге. Выпишите протеинограмму – соотношение белковых фракций - здорового ребенка и взрослого человека. 5. Опишите сущность электрофоретического разделения белков на полиакриламидном геле, принцип диск-электрофореза.
Вспомните метод хроматографии белков.	1.Выпишите классификацию методов хроматографического разделения белков по механизму разделения и технике проведения.

ГОМОГЕНИЗАЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

ЭКСТРАКЦИЯ БЕЛКОВ

ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ БЕЛКОВ

ВЫСАЛИВАНИЕ

ХРОМАТОГРАФИЯ

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ

ИНДИВИДУАЛЬНЫЙ БЕЛОК

ОЧИСТКА ОТ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ПРИМЕСЕЙ

ДИАЛИЗ

ГЕЛЬ- ХРОМАТОГРАФИЯ

УЛЬТРА- ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ

Рисунок 4. Схема «Выделение и очистка белков»

Примеры заданий для самоконтроля

Выберите наиболее правильный ответ.

1. МОЛЕКУЛЯРНАЯ МАССА БЕЛКОВ НАХОДИТСЯ В ПРЕДЕЛАХ

1) от 6000 до 10000000 и выше

2) свыше 50000

3) от 30000 и выше

4) свыше100000

2. ГЛУТАМИНОВАЯ КИСЛОТА ПРИ рН 10 НАХОДИТСЯ В ВИДЕ

1)

3)

2) 4)

3. СМЕСЬ АМИНОКИСЛОТ, СОДЕРЖАЩАЯ АСПАРТ (pI 3,0) И ЛИЗИН (рI 9,7), РАЗДЕЛЯЕТСЯ МЕТОДОМ ИОННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ. В КАКОМ ПОРЯДКЕ БУДУТ ВЫХОДИТЬ АМИНОКИСЛОТЫ ИЗ КОЛОНКИ С ТРИМТИЛАМИНОПОЛИСТЕРОЛЬНОЙ СМОЛОЙ (АНИОНООБМЕННИК) ПРИ рН 7?

1) асп, лиз

2) лиз, асп

4. ДЕТЕРГЕНТЫ (ТРИТОН Х-100, ДОДЕЦИЛСУЛЬФАТ НАТРИЯ) ПРИ ЭКСТРАКЦИИ БЕЛКОВ ДОБАВЛЯЮТ К СРЕДЕ ВЫДЕЛЕНИЯ ДЛЯ

1) повышения устойчивости белков к денатурации

2) перевода белков в изоэлектрическое состояние

3) разрушения белково-липидных комплексов

5.ОПТИЧЕСКОЕ ЯВЛЕНИЕ, ДОКАЗЫВАЮЩЕЕ КОЛЛОИДНЫЕ СВОЙСТВА РАСТВОРА БЕЛКА

1) явление светорассеивания – конус Тиндаля

2) вращение плоскости поляризованного света

3) интенсивное светопоглощение при длине волны 280 нм

6. СМЕСЬ АМИНОКИСЛОТ ПОДВЕРГЛИ ЭЛЕКТРОФОРЕЗУ НА БУМАГЕ ПРИ pH=6. К АНОДУ ДВИГАЮТСЯ

1) глицин

2) аланин

3) лизин

4) глутаминовую кислоту

5) аргинин

7. МЕТОД РАЗДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ, ОСНОВАННЫЙ НА РАЗЛИЧИИ РАЗМЕРА БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ

1)кристаллизация

2)диализ

3)ионообменная хроматография

4)гель-фильтрация

5)изоэлектрическое фокусирование

8. ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКАЯ ПРОЦЕДУРА, НЕ ЗАВИСЯЩАЯ ОТ ЗАРЯДА БЕЛКОВ

1) диск-электрофорез

2) зональный электрофорез

3) изоэлектрическое фокусирование

4) электрофорез в полиакриламидном геле с добавлением детергента (натрия додецилсультата)

5) электрофорез на бумаге

Примеры обучающих задач

Задача 1.При электрофорезе на бумаге белков сыворотки крови больного Р.С. получили следующие результаты: альбумины-48,5%, α₁-глобулины-12,6%, α₂-глобулины-7,3%, β-глобулины-14,8%, γ-глобулины-16,8%. Выделите изменения, обнаруженные в белковом спектре крови больного и рассчитайте величину белкового коэффициента, если общее содержание белка в крови у данного больного составляло 62 г/л.

Задача 2.Необходимо разделить смесь белков, содержащую церрулоплазмин (Mr151000, ИЭТ 4,4), β-лактоглобуллин (молекулярная масса 150000, ИЭТ 6,3) и γ-глобулин (молекулярная масса 37100, ИЭТ 5,2). Предложите методы разделения смеси этих белков. В какой последовательности будут выделяться эти белки из смеси?

Эталоны ответов к заданиям

1. -1); 2. -2);

3. –2)(аминокислота, имеющая наибольший отрицательный заряд прочнее удерживается положительно заряженными частицами смолы);

4. -3);5. –1).6.–4);7. –4); 8. -4) (детергент устраняет влияние заряда белка и разделение полностью определяется размером белковых молекул).

Эталоны ответов на задачи

Задача 1.Снизилось процентное содержание альбуминов (в норме альбумины составляют 55,4-78,9%), повысилось содержание α₁- и β-глобулинов. Соотношение количества альбуминов к количеству глобулинов в биологических жидкостях. В крови величина альбумины-глобулины в норме относительно постоянна и равна 1,5—2,3. Белковый коэффициент в данном случае снижен и составляет 0,93. Альбуминов в сыворотке крови больного содержится 30 г/л, глобулинов – 32 г/л.

Задача 2.Для отделения β-лактоглобулина, значительно отличающегося по величине молекулярной массы, можно использовать метод гель-фильтрации. Для разделения церрулоплазмина и γ-глобулина, имеющих различные значения ИЭТ, целесообразно использовать электрофорез.

Раздел 2. Ферменты