Нефелометрические коагулометры

Нефелометрические коагулометры определя­ют момент образования сгустка по изменению рассеяния света. Новейшие разработки в этой области технологий нашли воплощение в коагу-лометрах фирмы «Sysmex» (Япония), в которых используется принцип определения сгустка по бо­ковому рассеиванию света (рис. 87). Метод рас­сеивания обеспечивает высокое качество анали­зов - высокую специфичность и чувствительность метода детекции сгустка даже для сложной липе-мичной или иктеричной плазмы.

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Рис. 86. Оптический двухканальный коагулометр KG-1 производства компании «Соrmау».Точность результатов повышается за счет синхронизации времени попадания ре­агента в измерительную кювету и запуска отсчета времени, а также исключения из применения магнитных мешалок в измерительных кюветах, Прибор эргономичен, термостат для проб и реагентов размещен в самом приборе, у кювет есть перемычки и держатели для удобства переноса из термо­стата в измерительные ячейки. Работа на приборе эконом­на, так как снижен расход реагентов за счет уменьшения объема кювет, использования многоразовых кювет

Рис. 87. Нефелометрический принцип измерения све­торассеяния,заложенный в основу определения момен­та выпадения сгустка на коагулометрах фирмы «Sysmex» (Япония). Метод позволяет повысить точность измерений и их воспроизводимость до 2-3%, а также снизить влияние на результат самого образца. Анализаторы работают на любых реагентах (в том числе на российских)

В табл. 15 указаны преимущества и недостат­ки автоматизированных коагулометров, исполь­зующих разные принципы регистрации выпада­ющего сгустка.

Современные коагулометры сочетают в од­ном приборе несколько методов измерения, по-

этому могут использоваться для комплексной оценки гемостаза. Так, фирма «Sysmex» предла­гает серию коагулометров с разными возможно­стями и производительностью для любой клини­ко-диагностической лаборатории любого уровня исследования гемостаза (рис. 88).

Таблица 15

Преимущества и недостатки различных методов обнаружения сгустка

Методы	Преимущества	Недостатки
Механический	Принципиальная возможность работы на цельной крови, высокая толерантность к типу используемых реагентов и пробирок, низкая стоимость анализаторов	Низкая чувствительность - нет детекции слабых сгустков, необходимо применять мешалки в пробах
Оптико-механический	Точность больше, чем в механическом мето­де, перемешивание пробы во время снятия показаний	Чувствительность ниже нефело-метрического метода, необходимо приме­нять мешалки в пробах
Турбидиметриче-ский	Чувствительность выше предыдущих мето­дов, низкая стоимость анализаторов	Чувствительность ниже нефело-метрического метода
Нефело­метрический	Высокая чувствительность, высокая точность измерения	Высокая стоимость прибора

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Рис. 88. Коагулометры фирмы «Sysmex»

Амидолитические методы с использованием хромогенных и флуорогенных субстратов

Применение синтетических хромогенных суб­стратов явилось прорывом при исследовании от­дельных ферментов или ингибиторов, которые не учитываются простыми коагуляционными теста­ми или очень трудны для стандартизации. Во мно­гих случаях хромогенные субстраты являются спе­цифичными и позволяют определить протеолити-ческую активность отдельных компонентов плаз­менного гемостаза и их ингибиторов. Эти тесты схожи с тестами клинической химии, поэтому лег­ко автоматизируются и могут выполняться на био­химических анализаторах как в клинико-диагнос­тических, так и в научных лабораториях.

Принцип тестов с хромогенными субстрата­ми представлен на рис. 89. Протеаза расщепляет короткоцепочечный пептид (из 3-10 аминокис­лот), к которому через эфирную связь пришит хромоген (в нашем случае паранитроанилин -pNA). Комплекс пептид-pNA имеет максимум поглощения в области короткого ультрафиоле­та, свободный pNA - при 380 нм. Итоговая кон­центрация pNA пропорциональна активности протеазы и определяется по увеличению погло­щения светового пучка с длиной волны 405 нм.

Рис. 89. Принцип определения активности протеолити-ческого фермента (протеазы) с использованием хро-могенного субстрата.Максимум поглощения паранитро-анилина, связанного с пептидом, находится в области ко­роткого ультрафиолета, а свободного паранитроанилина -380 нм, При длине волны 405 нм поглощает практически толь­ко свободная форма хромогена, на этой длине волны про­водится регистрация протеолитической реакции

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Для оценки активности факторов гемостаза стали использовать флуорогенные субстраты,в

частности 7-амино-4-метилкумарин (АМК), кото­рый имеет максимум эмиссии при 440 нм. Флуо­рогенные субстраты обладают большей аналити­ческой чувствительностью и позволяют измерить специфическую активность компонентов гемо­стаза в большем диапазоне, чем хромогенные суб­страты. Они могут использоваться для определе­ния компонентов гемостаза, присутствующих в плазме в следовых концентрациях или обладаю­щих относительно низкой активностью.

Преимущества использования хромогенных и флуорогенных субстратов:

• Высокая чувствительность метода. pNA или
АМК обладают фотометрическими характе­
ристиками, позволяющими использовать ки­
нетические методы измерения.

• Высокая специфичность. Для каждой отдель­
ной сериновой протеазы системы гемостаза
известна структура участка гидролиза. Моде­
лирование в короткоцепочечном пептиде спе­
цифической для конкретной протеазы после­
довательности из 3 аминокислот позволяет
исключить влияние других протеаз на резуль­
таты исследования. При синтезе хромогенных
субстратов для повышения специфичности
используются L- или D-стереоизомеры амино­
кислот, а также различные блокирующие груп­
пировки, чтобы предупредить деградацию их

неспецифическими аминопептидазами. Кроме того, в тестах используется концентрация хро­могенных субстратов в несколько сотен мкмоль/л, что существенно выше, чем констан­та Михаэлиса (К_м) соответствующих фермен­тов, поэтому скорость реакции не зависит от концентрации субстратов. Факторы, которые необходимо учитывать при использовании хромогенных субстратов в практи­ческой клинико-диагностической лаборатории:

• Растворимость субстратов должна быть хо­
рошей.

• Реакция должна быстро достигать линей­
ность, чтобы использовать соответствующий
набор на биохимических анализаторах, в ко­
торых часто бывает ограниченным время
проведения измерения.

• В пробе не должно быть мутности, которую
часто привносит фибрин или денатурирован­
ные белки.

Недостатки метода с использованием хромо­генных субстратов:

• Высокая стоимость реактивов.

• Возможное завышение результатов при иссле­
довании активности витамин-К-зависимых фак­
торов у лиц, получающих непрямые антикоа­
гулянты либо имеющих дефицит витамина К.
Некоторые хромогенные субстраты, исполь­
зуемые для определения активности факторов
свертывания, представлены в табл. 16.

Таблица 16

Типичные хромогенные и флуорогенные субстраты и ингибиторы, применяемые для выявления активности протеолитических ферментов системы гемостаза

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Иммунохимические методы

Иммунохимические методы активно начали внедряться в клинико-диагностических лаборато­риях с целью исследования гемостаза в последнее десятилетие. Они позволяют количественно оп­ределять концентрацию конкретного белка, что отличает их от коагуляционных методов и мето­дов с хромогенными субстратами, в которых оп­ределяется функциональная активность компо­нентов, а не их концентрация. Первые тест-сис­темы не позволяли различить активные и неак­тивные (профакторы) компоненты системы гемо­стаза. В последнее время предлагается все боль­ше тест-систем для определения концентрации активных компонентов свертывания, их кофак­торов, активаторов, ингибиторов, продуктов про-теолитического гидролиза, а также сформировав­шихся субстрат-ферментных комплексов. Эти те­сты основаны на использовании специфических антител. В современных клинико-диагностичес­ких лабораториях доступными стали иммунохи­мические методы для ручного и автоматизирован­ного использования, основанные на латекс-агг­лютинации (рис. 90) и методе ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).

Латекс-агглютинация

Латекс-агглютинация выявляется визуально или на автоматизированных нефелометрах. Не-

достатком этого подхода является нелинейность оптического сигнала при турбидиметрическом и нефелометрическом методах регистрации.

Метод ELISA

Метод ELISA (рис. 91) для выявления кон­центрации факторов гемостаза, как правило, использует принцип «сендвича». На стенки мик­роплашки наносятся антитела к исследуемому фактору гемостаза (твердая фаза). После добав­ления плазмы происходит осаждение специфи­ческого антигена (белка системы гемостаза) на фиксированных антителах. Плашка промыва­ется и заполняется вторичными антителами, взаимодействующими с этим же белком, но по другим эпитопам (антигенным структурам). Вторичные антитела конъюгированы с фермен­том (ELISA), радиоактивной меткой (РИА), люминесцентной меткой (ЛИА). В тесте ELISA после отмывки несвязавшихся антител добав­ляется субстрат ферментативной реакции и хро­моген. Изменение светопропускания раствора пропорционально количеству антигена (факто­ра), осажденного на фиксированных антителах. Методика позволяет оценить этот параметр количественно в концентрации <1 нг/мл, что достаточно для многих компонентов свертыва­ющей системы.

Рис. 90. Принцип латекс-агглютинации.Латексные час­тицы, покрытые антителами против фактора гемостаза, при взаимодействии с этим фактором (антигеном) образуют агрегаты, видимые визуально или регистрируемые на со­ответствующих приборах

Рис. 91. Принцип ELISA.На плашке, покрытой антителами против фактора гемостаза, связывается антиген, Проявля­ющие антитела, конъюгированные с ферментом, связыва­ются с антигеном. Фермент меняет цвет хромогена про­порционально количеству антигена

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

В настоящее время значительное развитие получают быстрые качественные и полуколиче­ственные иммунохимические иммунодиффузион-ные методы, основанные на визуальном опреде­лении реакции антиген-антитело.

Радиальная иммунодиффузия

Метод радиальной иммунодиффузии (РИД) основан на образовании колец преципитации в результате взаимодействия специфических анти­тел, содержащихся в геле, с анализируемым ан­тигеном, помещаемым в углубления стандартно­го размера (рис. 92). В результате диффузии в геле растворимых антигенов кольцо преципитации образуется в зоне оптимального соотношения антиген/антитело. Площадь, ограниченная коль­цом преципитации, пропорциональна количеству антигена.

«Ракетный» иммуноэлектрофорез

«Ракетный» иммуноэлектрофорез - иммуноло­гический метод, сочетающий в себе электрофорез и иммунодиффузию (рис. 93). Метод дает возмож­ность различить сходные по электрофоретической подвижности вещества с помощью специфической реакции преципитации между антигеном, помеща­емым на гелевую (целлюлозо-ацетатную) пластин­ку, и соответствующими антителами, которые со­держатся в ней. Длина «ракетных» иммунопреци-питатов пропорциональна концентрации антиге­на. Метод довольно прост в исполнении и облада­ет относительно высокой точностью.

При фундаментальном подходе к исследовани­ям компонентов гемостаза применение флуоресцент­ной или люминесцентной меток повышает чувстви­тельность иммунохимических методов и расширяет спектр определяемых компонентов.

Ат	Ат	Ат
Ат		Ат
Ат	Ат	Ат

Ат	Ат	Ат
	Ат-Аг
Ат Щ	О	Ат
	Ат-Аг
Ат	Ат	Ат

Рис. 92. Принцип метода радиальной иммунодиффу­зии,

используемый для полуколичественной оценки неко- Рис. 93. Принцип метода «ракетный» иммуноэлектро-

торых факторов гемостаза форез

Скрининговые тесты оценки плазменного звена гемостаза

Лабораторная диагностика нарушений систе­мы гемостаза является одной из самых дорогосто­ящих в лабораторной практике. Выполнение всех возможных тестов для уточнения характера нару­шений для всех пациентов - практически недоступ­ная задача. Поэтому чрезвычайно важно соблю­дать этапность проведения тестов, исходить из клинических данных и анамнеза пациента.

На первом этапе для уточнения направленнос­ти нарушений необходимо провести тесты, отража­ющие состояние целых звеньев системы гемостаза. Поскольку в разных лабораториях при анализе ге­мостаза преследуются разные цели, перечень тестов, входящих в гемостатический скрининг для данной лаборатории, может отличаться от такового в дру-

гих лабораториях. Однако существует набор тестов, традиционно называемых (и рекомендуемых) скри-нинговыми для диагностики состояния системы ге­мостаза. Обычно к ним относят определение вре­мени кровотечения и несколько тестов, оцениваю­щих состояние плазменного звена гемостаза, кото­рые входят как основной компонент в понятие коа-гулограммы.Наиболее полно этапность разработа­на для диагностики геморрагических нарушений. Скрининговые тесты:

• Время кровотечения.

• Количество тромбоцитов.

• АЧТВ.

• Протромбиновое время (по Квику).

• Тромбиновое время и/или фибриноген.

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Для пациентов с тромботическими заболева­ниями адекватного скрининга для диагностики нарушений системы гемостаза не разработано. Имеет смысл проведение исследования наиболее значимых маркеров тромбофилии, о которых бу­дет говориться ниже. Однако есть возможность контроля активности самого процесса патологи­ческого тромбообразования на основе анализа концентрации маркеров тромбообразования.

Скрининговые тесты на состояние внутренне­го и внешнего каскада активации протромбиназы позволяют выявлять нарушения со стороны фак­торов-субстратов, кофакторов, ингибиторов кас­када свертывания, а также действие некоторых

лекарственных препаратов или аутоантител. Ос­новным тестом на состояние внутреннего каскада свертывания плазмы является АЧТВ, на состояние внешнего каскада - ПВ. Их диагностическое зна­чение представлено в табл. 17 и на рис. 94.

Несмотря на то что в тестах АЧТВ и ПВ уча­ствует большинство плазменных факторов, дале­ко не во всех случаях при патологии того или иного звена или действии лекарственных препа­ратов эти показатели меняются (табл. 18). Коагу-лограмма - это комплексный анализ по многим тестам, совокупность которых может позволить определить конкретную причину нарушения свер­тывания крови.

Таблица 17

· Концентрация фибриногена начинает влиять на результаты тестов при снижении ее ниже определенного порога. Как правило, эти тесты не позволяют количественно определить фибриноген или заподозрить уме­ренное снижение его концентрации.

Рис. 94. Факторы, влияющие на результаты скрининговых тестов АЧТВ и ПВ.Звездочкой зависимые факторы, на которые влияют антикоагулянты непрямого действия

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Таблица 18

Изменение А ЧТВ и ПВ при патологии отдельных компонентов плазменного звена гемостаза

и влиянии некоторых лекарственных средств

Активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ)

В названии АЧТВ (иногда его обозначают как активированное парциальное тромбопласти­новое время, АПТВ) слово «частичное», или «пар­циальное», указывает на то, что в тесте использу­ются реагенты, содержащие фосфолипиды, а не тканевые факторы (в этом отличие от ПВ, где используется тканевой тромбопластин). Факто­ры и взаимные влияния некоторых из них на АЧТВ представлены на рис. 95.

АЧТВ используется как скрининговый тест для оценки внутреннего каскада свертывания плазмы, скрининговой диагностики волчаночно­го антикоагулянта и слежения за антикоагулянт-ным действием гепаринов. АЧТВ - более значи­мый тест для первичного выявления патологии,

чем ПВ, так как выявляет относительно часто встречающуюся гемофилию А и В (дефицит фак­торов VIII и IX соответственно) и наличие вол­чаночного антикоагулянта.