Молекулярно-биологические методы

Высокоинформативным методом, сочетаю­щим иммунохимические технологии с исследо­ванием клеточных популяций, является проточ­ная цитометрия.Проточная цитометрия позво­ляет охарактеризовать клеточные популяции, их размеры, стадию дифференцировки. Этим мето­дом определяют наличие или отсутствие на кле­точной поверхности специфических рецепторов или продуктов клеточной активации, субпопу­ляции тромбоцитов и даже циркулирующие эн-дотелиальные клетки. Метод возможен при на­личии проточного цитометра и специфических реактивов, в первую очередь моноклональных антител. Основным достоинством этой техноло­гии является возможность разделить клеточные популяции на активированные и неактивные. Тем не менее использование данной технологии для оценки гемостаза используется крайне ред­ко, так как технология дорогая и требуется вы­сококвалифицированный персонал, подготов­ленный в области проточной цитометрии и ге-мостазиологии.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)начина­ет внедряться в лаборатории, занимающиеся ге-

мостазом, в первую очередь наследственными нарушениями свертывания крови. Наследствен­ные заболевания связаны с отсутствием или дис­функцией белков в результате мутаций в генах, кодирующих их синтез. Задачей молекулярно-биологических методов является выявление этих мутаций. Обширные молекулярно-генетические исследования проводятся при диагностике гемо­филии А и В, а также болезни Виллебранда. ПЦР используется для выявления мутаций фактора V Лейден, протромбина 20210G→A, полиморфиз­ма фактора XIII, дефицита AT, протеинов С и S и в других случаях. ПЦР и другие методы моле­кулярной и генной диагностики используются для выявления наследственных заболеваний, при ко­торых нарушения гемостаза являются сочетанной формой патологии.

Эти методы играют очень важную роль в пре-натальной диагностике, объектом для исследова­ния может быть амниотическая жидкость или хорион, которые можно получить на 8-10-й не­деле беременности. Этими исследованиями мож­но выявить гетерозиготное и гомозиготное носи-тельство патологических генов.

Методические основы лабораторной оценки плазменного гемостаза

Коагуляционные методы

Коагуляционные, или клоттинговые, методы основаны на определении промежутка времени от добавления стартового реактива, запускающего каскад свертывания плазмы, до момента образо­вания сгустка (выпадения фибрина). При поста­новке коагуляционных тестов необходимо пере­мешать плазму с реактивом до гомогенной сус­пензии и поддерживать стабильной температуру реакции. Коагуляционные тесты - в настоящее время наиболее распространенный методический подход для оценки плазменного гемостаза в кли­нико-диагностических лабораториях. Необходи­мо подчеркнуть, что коагуляционные методы яв­ляются скрининговыми, тем не менее на их осно­ве сконструирован ряд методов для оценки актив­ности факторов плазмы.

Ручные методы

Ручные методы обнаружения момента выпа­дения сгустка проводятся на водяной бане. Авто­матическая регуляция температуры воды только частично решает проблему поддержания посто­янной температуры. Частое вынимание пробир­ки во время исследования для наблюдения за по­являющимся сгустком является причиной того, что температура реакции не соответствует тем­пературе водяной бани. При визуальной оценке времени появления сгустка даже опытному лабо­ранту невозможно точно установить момент по­явления сгустка, что является главной причиной плохой повторяемости результатов. Однако сле­дует помнить, что в ситуациях, в которых отсут­ствуют или подводят автоматические методы

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

(формируется неплотный сгусток), применение этого метода обоснованно.

Точность определения времени больше зави­сит от исследователя, чем от типа используемого в исследованиях секундомера. Удовлетворитель­ной следует считать точность определения време­ни до 0,5 с. К недостаткам этого метода можно отнести длительность его выполнения и необхо­димость максимального внимания во время про­ведения исследования.