Схема постановки реакции агглютинации

┌──────────────┬─────────────────────────────────────┬──────────────────┐

│Ингредиенты │ Разведения исследуемой сыворотки │ Контроли │

│ ├─────┬─────┬─────┬─────┬──────┬──────┼─────┬──────┬─────┤

│ │ │ │ │ │ │ │ │сыво- │анти-│

│ │1:10 │1:20 │1:40 │1:80 │1:160 │1:320 │1:640│ротки │гена │

├──────────────┼─────┼─────┼─────┼─────┼──────┼──────┼─────┼──────┼─────┤

│Сыворотка (мл)│ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ - │

├──────────────┼─────┼─────┼─────┼─────┼──────┼──────┼─────┼──────┼─────┤

│Антиген (мл) │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ - │ 0,2 │

├──────────────┼─────┼─────┼─────┼─────┼──────┼──────┼─────┼──────┼─────┤

│Физ.раствор │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ (мл) │ - │ - │ - │ - │ - │ - │ - │ 0,2 │ 0,2 │

└──────────────┴─────┴─────┴─────┴─────┴──────┴──────┴─────┴──────┴─────┘

После термостата штативы выдерживают два часа при комнатной температуре, не встряхивая пробирки, поскольку образуемый агглютинат имеет вид нежного перевернутого зонтика и очень легко разрушается. После этого учитывают результаты реакции.

Учет результатов.

Результаты реакции учитываются невооруженным глазом или с помощью агглютиноскопа по 4-х крестной системе:

- полное просветление жидкости над осадком, имеющим вид перевернутого зонтика - четыре креста (++++);

- неполное просветление жидкости над таким же осадком - три креста (+++);

- мутная жидкость при наличии небольшого зернистого осадка на дне и стенках пробирки - два креста (++);

- мутная жидкость, возможен осадок в виде точки - один крест (+).

Реакция считается положительной при наличии интенсивности агглютинации риккетсий на три креста в конечном разведении; в контролях сывороток и антигена не должно быть агглютинации, а титр стандартной сыворотки должен соответствовать указанному на этикетке (допускается изменение титра на одно разведение).

2.5. Определение специфических антител к риккетсиям Провачека
иммуноферментным методом

Принцип иммуноферментного анализа (ИФА) основан на образовании иммунного комплекса специфических антител с антигеном, иммобилизированном на полистироловом планшете, с последующем его выявлением антивидовым конъюгатом, меченым ферментом. Ферментативная активность пропорциональна содержанию специфических антител в сыворотке и проявляется при помощи субстратов для данного фермента.

Иммуноферментный метод обладает рядом существенных преимуществ перед традиционными иммунологическими реакциями; главным из которых является высокая чувствительность, специфичность, возможность получения количественных данных, воспроизводимость, стандартизация основных ингредиентов анализа, исследование сильно загрязненных образцов, возможность автоматизации всех этапов постановки.

Метод ИФА применяют для серодиагностики эпидемического сыпного тифа и болезни Брилля, как наиболее чувствительной и позволяющей выявить инфекцию независимо от ее клинической выраженности.

1. Ингредиенты реакции, необходимые для постановки ИФА.

1.1. Коммерческие цельнорастворимые антигены p.Провачека для РСК.

1.2. Положительная сыпнотифозная контрольная сыворотка человека (К+).

1.3. Сыворотки людей, не содержащие антигены к риккетсиям Провачека (К-).

1.4. Буфер адсорбции или присоединения pH 9,5 - 9,7

1.5. Буфер инкубации или разведения, pH 7,2 - 7,4

1.6. Буфер промывки, pH 7,2 - 7,4

1.7. Субстрат-индикаторный раствор, pH 5,5 - 6,0

1.8. Антивидовой конъюгат - антитела диагностические против иммуноглобулинов человека, меченые пероксидазой, сухие (производство НИИЭМ им.Гамалеи РАМН)

1.9. Серная кислота (H2S04).

2. Оборудование.

2.1. Пипетки стеклянные на 1 мл, 2 мл, 5 мл, 10 мл.

2.2. Микропипетки стеклянные на 0,1 мл, 0,2 мл.

2.3. Автоматические пипетки P-20 (на 20 мкл), Р-200 (на 200 мкл), P-1000 (на 1000 мкл).

2.4. Химические колбы и пробирки.

2.5. Бутылки на 3 л и 5 л.

2.6. Весы технические с разновесами.

2.7. Весы торзионные или аналитические с разновесами.

2.8. pHметр.

2.9. Резиновые груши.

2.10. Планшеты для иммунологических реакций однократного применения.

2.11. Холодильник бытовой.

2.12. Бумага фильтровальная.

1.13. Термостат.

2.14. Фотометр.

3. Реактивы.

3.1. Карбонат натрия (Na2CO3).

3.2. Бикарбонат натрия (NaHCO3)

3.3. Натрий фосфорнокислый однозамещенный (NAH2PO4 x 2H2O).

3.4. Натрий фосфорнокислый двузамещенный (Na2HРO4 x 12H2O).

3.5. Хлористый натрий (NaCl).

3.6. Твин 20.

3.7. Лимонная кислота.

3.8. 3% раствор перекиси водорода (H2O2).

3.9. Орто-фенилендиамин (ОФД).

3.10. 1 н раствор серной кислоты (H2SO4).

3.11. Вода дистиллированная.

Подготовка ингредиентов реакции.

Антиген разводят в 0,05 М карбонат-бикарбонатном буфере, pH 9,5 - 9,7 (буфер присоединения) в раститровке. Рабочее разведение подбирают "шахматным" титрованием антигена, антител (положительного и отрицательного контроля) и конъюгата.

Для каждой новой серии антивидового конъюгата, антигена или при смене полистироловых планшетов одной фирмы на другую, необходимо снова опытным путем ("шахматное" титрование) подобрать оптимальные разведения антигена и конъюгата, которые станут рабочими. Сыворотки разводят в 0,02 М фосфатно-солевом буфере, pH 7,2 - 7,4 содержащем 0,1% детергента (твин 20) для уменьшения неспецифической реакции (буфер инкубации). В качестве буфера промывки используют буфер инкубации.

Антивидовой конъюгат разводят в 0,02М фосфатно-солевом буфере, содержащем 0,1% твин 20 и 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) для уменьшения неспецифической сорбции конъюгата на полистирол, сенсибилизированный антигеном. Необходимо помнить, что при разведении конъюгата перемешивать раствор надо осторожно, не вспенивая его, так как это приведет к денатурации фермента.

Субстрат для перексидазы (ОФД) разводят в 0,1М цитратно-фосфатном буфере pH 5,5 - 6,0 незадолго до использования не более чем за 30 - 60 минут до использования.

Все буферные растворы готовят заранее и хранят при температуре +4°С. Буфер с твином не хранится на холоду и используется в тот же день при комнатной температуре. Исходный раствор коммерческого цельнорастворимого антигена в стерильном физрастворе хранят около месяца при температуре +4°С.

К исходному раствору коммерческого конъюгата (антитела диагностические против иммуноглобулинов человека, меченые пероксидазой) добавляют равный объем стерильного глицерина, в качестве антифриза и хранят на холоду -10°С до срока годности, указанного на ампуле.

Пероксидаза отличается способностью активировать перекись водорода таким образом, чтобы она в присутствии окисляющих веществ (ОФД) отдала им один атом кислорода. В отсутствие окисляющих веществ, пероксидаза не разлагает перекись водорода. Поэтому активность пероксидазы определяют в среде, содержащей 0,04% ОФД и 0,04% перекиси водорода в 0,1М цитратно-фосфатном буфере pH 5,5 - 6,0, инкубируя в течение 30 минут, реакцию останавливают добавлением равного объема 1H серной кислоты, определяя оптическую плотность при 492 нм на фотометре.

Готовят субстрат - индикаторный раствор непосредственно перед внесением на планшет, добавляя в раствор ОФД в 0,1М цитратно-фосфатном буфере pH 5,5 - 6,0 свежеприготовленную из пергидроли (33% - 50%) 3% перекись водорода, перемешивают и быстро разливают в лунки планшета, после чего планшет помещают в темное место, или тщательно прикрывают, оставляя инкубироваться при комнатной температуре. Оставшийся субстрат-индикаторный раствор должен оставаться бесцветным в течение 30 минут при комнатной температуре. Если раствор субстрата начинает менять окраску в желтый цвет различных оттенков (от светло-желтого до коричнево-оранжевого), это говорит об окислении ОФД разлагающейся перекисью водорода под воздействием шероховатой, плохо промытой от щелочи стеклянной посуды. Необходимо отметить, что при длительном хранении перекиси водорода в стеклянной емкости происходит ее медленное разложение под влиянием следов щелочи, которые попадают в раствор вследствие растворения стекла. Чистые, без всяких добавок, растворы перекиси водорода сохраняют в парафинированных сосудах при комнатной температуре, в этих условиях скорость разложения перекиси водорода равна нулю.

Постановка реакции.

В лунки планшета вносят коммерческий антиген в раститровке или в рабочем разведении по 0,1 мл (100 мкл).

Планшеты закрывают крышкой и оставляют на 16 - 18 часов при +4°С (это можно сделать за день до всего объема работы) или помещают в термостат при +37°С на 2 часа для сенсибилизации лунок планшета антигеном.

Содержимое лунок интенсивно встряхивают, а лунки заливают до верха буфером промывки, содержащим 0,1% твин-20. Инкубируют 5 минут при комнатной температуре, встряхивают, подсушивают, интенсивно постучав о фильтровальную бумагу, и вновь повторяют процедуру промывки (3 раза).

После последней промывки планшет тщательно высушивают, интенсивно постукивая о фильтровальную бумагу (или чистое полотенце), так чтобы на дне лунок не оставалось влаги.

Вносят двукратное разведение сывороток, начиная с диагностического титра 1:500 по 0,05 мл (50 мкл). Желательно работать с параллелями, внося одно разведение не менее чем в две лунки.

Планшет закрывают крышкой и помещают в термостат (+37°С) на 1 час. В течение этого времени происходит образование иммунного комплекса антиген-антитело.

Содержимое лунок встряхивают и промывают, как указано в п.5.3.

Очевидно, в тексте настоящих указаний допущена опечатка. Имеется в виду пункт 5.2 приложения 4 к настоящему приказу

Вносят антивидовой конъюгат (антитела диагностические против иммуноглобулинов человека, меченые пероксидазой) в рабочем разведении или в раститровке в лунки планшета по 0,05 мл (50 мкл). Конъюгат разводят в буфере инкубации, содержащем 0,1% твин-20 и 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) для уменьшения неспецифической сорбции конъюгата на иммунный комплекс антиген-антитело.

Планшет закрывают крышкой и помещают в термостат (+37°С) на 30 минут. При этом происходит специфическое присоединение трех молекул антивидового конъюгата к Fc фрагменту антитела в иммунном комплексе антиген-антитело.

Содержимое лунок встряхивают, промывают 3 - 4 раза дистиллированной водой, заливая лунки до верха и сразу встряхивая без инкубации, а затем провести процедуру промывки как в п.5.3. желательно по 3 - 4 раза по 5 минут.

Во все лунки тщательно высушенного планшета вносят субстрат - индикаторный раствор по 0,05 мл (50 мкл).

Планшет оставляют в темноте при комнатной температуре в течение 20 - 30 минут. За это время происходит окисление ОФД перекисью водорода, катализируемое ферментом (пероксидазой) и окраска содержимого лунок меняется от бесцветного до желтовато-коричневой, темно-коричневой различной интенсивности (в зависимости от концентрации фермента в присоединившемся конъюгате к комплексу антиген-антитело).

Реакцию останавливают внесением 0,05 мл (50 мкл) 1Н серной кислоты. Оценивать реакцию можно как визуально, так и инструментально на фотометре при длине волны 492 нм.

Контроли.

"Негативный" контроль - сыворотка людей, содержащая неспецифические антитела (заведомо отрицательная), в диагностическом титре 1:500.

"Позитивный" контроль - сыворотка людей, содержащая специфические антитела (заведомо положительная), в раститровке, начиная с диагностического титра 1:500.

Контроль субстрата - субстрат-индикаторный раствор без антигена, сыворотки и антивидового конъюгата.

На каждый из контролей отводят две лунки. Необходимо ставить все контроли на каждом планшете любого опыта.

Учет результатов реакции.

Реакцию учитывают в том случае, если интенсивность окрашивания "позитивного" контроля превышает не менее чем вдвое окраску "негативного" контроля в том же разведении. Также оценивают и испытуемые сыворотки, сравнивая их окрашивание с окрашиванием "негативного" контроля в диагностическом титре 1:500. За титр испытуемой сыворотки принимают последнее наибольшее разведение сыворотки, превышающее в 2 раза интенсивность "негативного" контроля. Обычно положительная проба имеет на глаз желто-коричневую окраску различной интенсивности в отличие от бесцветной или слегка желтоватой "негативного" контроля. Реакцию можно оценивать как визуально, так и инструментально на фотометре при длине волны 492 нм. Результаты выражают в единицах оптической плотности (ОП), за положительный результат принимают то разведение нетитруемой сыворотки, которое дает превышение оптической плотности "негативного" контроля в диагностическом титре 1:500 в 2 и более раз.

Для сывороток больных с диагнозом "болезнь Брилла" обычно характерны титры 1:64000 - 1:256000, тогда как титры людей, выявленных ретроспективно - 1:500 - 1:64000.

Состав буферов и растворов.

1. Буфер адсорбции или присоединения (покрывающий буфер) 0,02М карбонат-бикарбонатный буфер (КББ) pH 9,5 - 9,7

Na2CO3 - 1,18 g

NaHCO3 - 3,47 g

Разбавить дистиллированной водой до 1000 мл.

2. 0,02M фосфатно-солевой буфер (ФСБ), pH 7,2-7,4

Na2HPO4 x 12H2O - 17,9 g.

NaH2PO4 x 2H2O - 0,78 g.

NaCl - 42,5 g.

Разбавить дистиллированной водой до 5000 мл.

3. Буфер инкубации или разведения, pH 7,2 - 7,4

а) 0,02М ФСБ б) 0,02М ФСБ

твин-20 - 0,01% твин-20 - 0,01% + 1% БСА

4. Буфер отмывки, pH 7,2 - 7,5

0,02М ФСБ

твин-20 - 0,01%

5. 0,1М цитратно-фосфатный буфер (ЦФБ), pH 5,5 - 6,0

6,4 мл 0,2 М Na2HPO4 x 12H2O (17,9 г. на 250 мл дист. воды)

6,1 мл 0,1 М лимонной кислоты (5,255 г. на 250 мл дист. воды)

12,5мл дистиллированной воды.

6. Субстрат-индикаторный раствор

25,0 мл 0,1М ЦФБ

9 - 10 мг орто-финилендиамина

0,35 мл 3% перекиси водорода

7. 1Н раствор серной кислоты (H2SO4). Готовят из концентрированной серной кислоты 16H H2SO4.

10 мл концентрированной H2SO4 растворить

в 150мл дистиллированной воды.

Приготовление растворов.

Приготовление забуференного физиологического раствора.

В 1 л физиологического раствора (0,87% раствор хлористого натрия) растворить 1,513 г фосфорнокислого двузамещенного натрия и 0,204 г фосфорнокислого, однозамещенного калия. pH забуференного физиологического раствора должен быть 7,4 - 7,5.

Приготовление вероналового буфера.

В мерный литровый флакон добавляют 200 мл буфера, затем наполняют флакон до литровой отметки раствором желатины и тщательно перемешивают. Измеряют pH.

Приготовление раствора буфера.

В 2-х литровый флакон добавляют 1,5 л дистиллированной воды

83,0 г NaCl

10,19г Na-5,5-диэтилбарбитурата

Перемешивают до полного растворения. Добавляют:

34,58 мл 1 М HCl и перемешивают

5,0 мл раствора MgCl2 CaCl2

Затем добавляют дистиллированную воду до отметки 2 литра и перемешивают.

Готовят разведения буфера 1:5 и измеряют pH.

Приготовление раствора MgCl CaCl .

2 2

В 250 мл флакон наливают 100 мл дистиллированной воды,

Добавляют: 20,3 г MgCl2 4,4 г CaCl2

Перемешивают.

Приготовление водного раствора желатины.

В сосуд емкостью 1 л наливают 100 мл дистиллированной воды и добавляют 1 г желатины. Кипятят. Охлаждают при комнатной температуре и добавляют 700 мл дистиллированной воды (срок хранения - 1 неделя).

Приготовление формалинизированного физиологического раствора.

В 1 л физиологического раствора добавить 3 мл 40% формальдегида.

Консерванты.

Консервант для комплемента.

Жидкий комплемент хранят при температуре - 20°С, либо консервируют химическими смесями: 0,05 г сернокислого натрия и 0,04 г кристаллической борной кислоты на 1 мл сыворотки (Гинзбург, Калинина, 1947).

Консерванты для эритроцитов.

1). Консервант крови N 7Б. Выпускается Саранским заводом медицинских препаратов в стерильных стеклянных флаконах емкостью 250 мл. Консерванта во флаконе - 50 мл. Консервирование эритроцитов проводят путем непосредственного соединения взятой от барана крови с консервантом.

2). Раствор "Глюгицир". Представляет собой глюкозо-цитратный раствор N 7-б без левомицетина. Выпускается Пензенским заводом медицинских препаратов в стеклянных флаконах. Консерванта во флаконе - 75 мл.

Взятие и обработка крови для серологических реакций.

Для серологических реакций предпочтительнее брать кровь из пальца. Кровь из пальца берут следующим образом.

Кожу пальца (предпочтительно 4-го левой руки) протирают спиртом или эфиром и слегка подсушивают. Иглой или пером для оспопрививания наносят резкий укол в мякоть пальца, появившуюся первую каплю крови удаляют тампоном, а затем, легким ритмичным сжатием пальца с боковых поверхностей, выдавливают несколько капель крови. Кровь набирают градуированной пипеткой (1 мл или 2 мл) и переносят в приготовленную стерильную пробирку, которую рекомендуется держать наклонно для получения скошенной поверхности крови. Необходимый объем крови - 1 - 1,5 мл. Пробирки с кровью помещают в термостат для образования сгустка. Образовавшийся кровяной сгусток отделяют от стенок пробирки пастеровской пипеткой или тонкой прокаженной и остуженной проволокой, бактериологической петлей или осторожным поколачиванием пробирки о ладонь. Пробирки с кровью помещают в рефрижератор или прохладное место для образования и отстаивания сыворотки.

На следующий день на кровяном сгустке образуется прозрачная, желтоватого цвета сыворотка, которую отделяют от сгустка в стерильную пробирку. Сыворотка не должна содержать эритроцитов! При условии срочного получения сыворотки, последняя отделяется от сгустка спустя 1 - 2 часа после его образования с помощью центрифугирования.

На пробирке с кровью должен быть указан или регистрационный номер больного, включающий сведения из журнала с его фамилии, имени, возрасте, дате взятия крови, дне болезни и диагнозе, или перечисленные сведения пишутся на этикетке, наклеенной на пробирку с кровью.

В случае, когда предполагается осложнение в получении нужного количества крови (1 мл), например, у детей, кровь забирают в пробирки, содержащие стерильный физиологический раствор с 0,25% лимоннокислым натрием (99,75 мл физиологического раствора + 0,25 мл лимоннокислого натрия).

В этом случае, объем взятой крови может быть сокращен до 0,4 мл. В пробирки предварительно набирают 1,8 мл раствора, препятствующего свертыванию крови, вносят 0,4 мл.

Хранение и транспортировка сывороток.

Разрушение сывороточных белков происходит в результате тепловой их денатурации, протеолиза или при изменении pH-растворов. Полное сохранение свойств сывороток (имеются в виду иммунные глобулины) обеспечивается при содержании их в замороженном (-70°С) или высушенном (под вакуумом) состоянии.

Риккетсиальные сыворотки, подлежащие исследованию на протяжении 7-14 дней, рекомендуется хранить при +4°С в ампулах, под резиновыми пробками в пробирках (можно ватными, но пропитанными парафином) по избежание высыхания сывороток. На более длительные сроки хранения сыворотки рекомендуется замораживать при -20°С (рекомендация научной группы ВОЗ), если отсутствуют условия для создания более низких температур (-70 или -196°С). Размораживают сыворотки при + 37°С.

Проверенным способом хранения риккетсиальных сывороток является их лиофилизация. По имеющимся наблюдениям в лиофилизированных сыворотках уровни титров антител не изменяются на протяжении до 15 лет хранения при + 4°С.

Высушенные на бумаге сыворотки пригодны для серодиагностики (в РСК) сыпного тифа, крысиного сыпного тифа, лихорадки Ку и риккетсиозов клещевой группы на протяжении до полутора месяцев их хранения при + 18 - 37°С.

Транспортировку сывороток, высушенных на бумаге, осуществляют в двойных конвертах по почте. Жидкие сыворотки в ампулах или лиофилизированные упаковывают в бумажные салфетки или вату и пересылают по почте бандеролями. Наилучший метод транспортировки жидких сывороток в сосудах (термосах с сухим льдом или в контейнерах с жидким азотом - объем контейнера 9,4 л вмещает 180 пробирок) автотранспортом. При пересылке проб в лабораторию извещают телеграммой о номере рейса, номере квитанции, дате, времени отправки и прибытии самолета.

Руководитель Департамента

госсанэпиднадзора

А.А.Монисов

Приложение 4

к приказу Минздрава РФ

от 26 ноября 1998 г. N 342

Методические указания
"Организация и проведение мероприятий по борьбе с педикулезом"

См. также Методические рекомендации "Вши человека" (Диагностика, медицинское значение, меры борьбы), утвержденные заместителем начальника Главного санитарно-эпидемиологического управления Минздрава СССР 5 июля 1990 г. N 15/6-28