Получение и применение бактериофагов.
1. Бактериофаги очень широко распространены в природе, они обнаруживаются там, где находятся чувствительные к ним бактерии ("сопровождают бактерии") – в воде, почве, молоке, в испражнениях больных кишечными заболеваниями, в гное и мокроте больных при других инфекциях. Особенно часто выделяется фаг в период выздоровления.
Чаще всего пользуются для выделения бактериофагов сточными водами путем фильтрования последних через бактериальные фильтры. О наличии бактериофага судят на основании просветления соответствующей бульонной культуры бактерий или образования "стерильных пятен" на плотных средах.
2. Для получения фага содержащий фаг материал (например, испражнения больных дизентерией) засевают в жидкую питательную среду (бульон) и выдерживают в термостате при 37° С 18-20 часов для накопления фага. Затем бульонную культуру фильтруют через бактериальные фильтры для отделения фага от бактериальных клеток. Фильтрат добавляют к свежей культуре дизентерийной палочки, а после ее просветления (свидетельство присутствия и размножения фага и лизиса бактериальных клеток) вновь проводят фильтрацию и добавляют к свежей культуре дизентерийной палочки, т.е. проводят многократное пассирование через культуру чувствительных к фагу бактерий, в результате чего увеличивается количество (титр) выделяемого фага. После накопления достаточного количества фага бульонную культуру вновь отфильтровывают и получают препарат фага. Таким образом, препараты фага – фильтраты бульонных культур лизированных ими бактерий (прозрачные жидкости светло-желтого цвета). Фаги также выпускают в виде таблеток с кислотоустойчивым покрытием, в форме мазей, аэрозолей и свечей (готовят из фильтратов).
3. На препаратах бактериофага обязательно указывается титр фага или количество фаговых частиц в единице объема или в 1 мг (или в 1 таблетке) препарата.
Количество фаговых частиц можно определить путем посева на чувствительную бактериальную культуру, растущую сплошным газоном на плотной питательной среде. В результате размножения фага, вызывающего лизис бактерий, образуются "стерильные пятна" ("бляшки") – негативные колонии фага (они имеют характерную для данного фага форму). Число колоний равно числу фаговых частиц, т.к. один фаг инфицирует одну бактериальную клетку, а стерильное пятно образуется уже в результате его репродукции.
4. Титр фага – наибольшее разведение фага, которое способно еще вызывать лизис чувствительных к нему бактерий.
Титрование – установление титра – можно осуществить на жидких и плотных питательных средах. Для этого препарат бактериофага разводят от 10-1 до 10-9 и более. К каждому разведению добавляют одинаковое количество суточной бульонной культуры соответствующих бактерий. Титр определяется после выдерживания в термостате по просветлению бульона в последней пробирке. Например, если первые шесть пробирок остались прозрачными, а в последующих разведениях и в контрольной пробирке имеется рост культуры, то титр фага 10-6. При титровании на плотных средах разведения фага наносят на засеянную сплошным газоном бактериальную культуру. Титр определяется по последней чашке, где еще имеются "стерильные пятна". В медицинской практике чаще всего применяются бактериофаги с титром 10-7 и 10-8.
5. Применение фага основано на его строгой специфичности. Они используются для:
а) диагностики инфекционных заболеваний – с помощью известного (диагностического) фага можно определить видовую или типовую принадлежность выделенной культуры. Определение фаговара – фаготипирование – имеет большое значение для выявления вариантов (типов) внутри вида, позволяет установить источник и пути распространения инфекции. В настоящее время разработано фаготипирование р. Salmonella, р. Vibrio, стафилококка. С помощью известной бактериальной тест-культуры можно определить неизвестный фаг в исследуемом материале, что свидетельствует о присутствии в нем соответствующих возбудителей. Присутствие возбудителей в исследуемом материале можно установить по нарастанию титра фага при внесении такого фага в исследуемый материал.
б) лечения и профилактики заболеваний. Лечебный эффект препаратов тем больше, чем раньше от начала болезни начато их применение. Установлена большая эффективность профилактического применения фагов. С профилактической целью их назначают лицам, соприкасавшимся с больным или бактерионосителем. Для получения лечебно-профилактических препаратов используют проверенные производственные штаммы фагов и соответственно типичные культуры микроорганизмов. Бактериальную культуру в жидкой питательной среде, находящуюся в стадии логарифмического роста, заражают маточной взвесью фага. Лизированную фагом культуру фильтруют через бактериальные фильтры и получают препарат.
На жидких и плотных питательных средах бактериофаги очень быстро растворяют соответствующие бактерии, но в организме человека лизис бактерий происходит не в полной мере (действие тормозится в присутствии крови, гноя, лимфы, содержимого кишечника), но бактерии становятся более податливыми действию защитных факторов организма.