Серодиагностика и ретроспективная диагностика

В настоящее время в лабораторной диагностике КЧС используются три метода обнару­жения специфических AT к ВКЧС: реакция нейтрализации флюоресцирующих микробля­шек (РНФБ), реакция непрямой ИФ и непрямой вариант твердофазного ИФА. Наиболее эффективными методами обнаружения специфических AT к ВКЧС являются РНФБ и ИФА. Эффективность обнаружения AT к ВКЧС в ИФА по сравнению с РНФБ составляла 96,5%. На основании этих данных непрямой вариант ИФА рекомендован для обнаружения специ­фических AT к ВКЧ.

НИФ. НИФ применяется для выявления и титрования AT в сыворотках крови перебо­левших свиней. Используют зараженные вирусом перевиваемые клетки (РК-15) на стек­лышках, на которых титруют испытуемые сыворотки в 2-кратных разведениях от 1:20 до 1:640 в непрямой ИФ по общепринятой методике с использованием во втором этапе реак­ции антисвиного ФИТЦ-Ig. Титром AT к КЧС считают последнее разведение сыворотки, обеспечивающее зеленое свечение (на 2 креста) диффузного цитоплазматического АГ виру­са при отсутствии подобного свечения в контролях с интактными тест-объектами и нор­мальной свиной сывороткой.

Реакция нейтрализации флюоресцирующих бляшек (РНФБ). В качестве чувстви­тельной системы необходимо использовать перевиваемую культуру клеток РК-15, выращен­ную на покровных стеклах в пробирках. РНФБ проводят микрометодом, используя пласти­ковые панели Titertek. Суспензию клеток (в 1 мл 10-800 тыс. клеток) готовят на среде Игла (MEM) с 5% фетальной сыворотки крови КРС с добавлением буфера HEPES. Постановка микрометодом РНФБ более производительна, чем использование макрометода (28). Данный метод может успешно применяться и для титрования специфических AT. Пробы сывороток крови берут от животных не ранее 15 дн. после клинического выздоровления. Пе­ред использованием их инактивируют при 56°С 30 мин. Сыворотки разводят от 1:2 до 1:2560 и смешивают с равным объемом вакцинного вируса в количестве 100 ККИД5о (клеточно-культуральных инфекционных доз), встряхивают и выдерживают 60 мин при 37°С. Каждое разведение сыворотки с вирусом вносят по 0,4 мл в 4 пробирки с культурой клеток РК-15 на стеклышках. Адсорбируют 2 ч при 37°С. Смесь сыворотка-вирус сливают, отмывают клетки средой, заливают 2 мл поддерживающей среды и инкубируют при 37°С. Реакцию учитывают через 48 ч инкубации. Препараты вынимают из пробирок, ополаскивают в 0,01 М ФБР рН 7,2-7,4 и обрабатывают, как указано выше. Реакция сопровождается соответствующими контролями (смесь вируса со средой, гипериммунной и нормальной сыворотками и незараженная культура клеток). От­сутствие флюоресцирующих микробляшек (при наличии их в контроле вируса в смеси с пи­тательной средой и нормальной сывороткой) в препаратах ВКЧС, обработанных гиперим­мунной и испытуемыми сыворотками в разведении 1:2 и выше, указывает на наличие в ма­териалах специфических AT. Титром AT считают то предельное разведение сыворотки, при котором наблюдается полное подавление образования флюоресцирующих микробляшек.

Во избежание получения ложных результатов при использовании культуры клеток необ­ходимо добавлять в среду бычью сыворотку, свободную от вируса диареи КРС и AT. BHA выявляются через 21 день после заражения. Обнаружение их с помощью непрямой ИФ в культуре клеток широко применяли в США на последних этапах программы искоренения болезни. Однако при интерпретации результатов следует учитывать частые случаи инаппарантной инфекции у свиней, вызванной серологически родственным вирусом диареи КРС, поэтому все положительно реагирующие сыворотки свиней необходимо исследовать и на вирус диареи.

Для массового обследования свиней на субклиническую инфекцию КЧС в ФРГ пред­ложен тест, сочетающий РН с ИФ. В качестве тест-системы используют культуру клеток РК-15. Если у одной или нескольких свиноматок отдельного стада в сыворотке крови обна­руживают BHA, всех поросят убивают с последующим исследованием органов ИФ.

При исследовании проб сывороток из неблагополучных хозяйств в РН (с 200-300 БОЕ патогенного шт. Альфорт 331) до 50% их оказалось положительными. Наличие AT свиде­тельствовало о носительстве вируса. Вирус смогли выделить только у молодых поросят.

Описана усовершенствованная методика выявления BHA к ВКЧС, в которой постановка теста значительно облегчена за счет использования цитолитического штамма вируса, выде­ленного из персистентно инфицированной перевиваемой культуры клеток JB-RS-2 и инду­цировавшего четкое ЦПД в нескольких перевиваемых линиях клеток почки поросенка. Ре­акцию ставят в культуре клеток РК-15 на микропанелях при 38°С в термостатах с подачей СО₂. По воспроизводимости и чувствительности методика не уступает реакции с ис­пользованием метода ИФ AT, но требует значительно меньшего труда. Предлагаемый метод обладает рядом преимуществ: исключает необходимость использования ИФ; учет результа­тов можно проводить без микроскопа; реакцию ставят микрометодом; используемый вирус аттенуирован. Для постановки РН необходимо вначале провести титрование ВКЧС.

ИЭОФ. Используется в 1%-ной агарозе как диагностический при выявлении AT к ВКЧС в сыворотках зараженных свиней. Для исследования применяется АГ, экстрагиро­ванный из зараженных ВКЧС клеток РК-15. Показано, что этот культуральный АГ ВКЧС идентичен преципитирующему АГ вируса, экстрагированного из ткани селезенки заражен­ных свиней. Обнаружено, что ПА к ВКЧС появляются в сыворотках через 2-3 нед. после за­ражения животных слабовирулентными штаммами или модифицированным живым вак­цинным штаммом. Выявлено, что метод ИЭОФ в 2-16 раз чувствительнее, чем иммунодиффузия в агаровом геле. Несмотря на меньшую его чувствительность по сравнению с РН, ре­зультаты, полученные с помощью ИЭОФ, хорошо согласуются с результатами, полученны­ми методом подавления бляшкообразования. Считается, что ПА к ВКЧС могут персистировать до 3 лет после 1-кратной вакцинации шт. С. Методом ИЭОФ невозможно было диф­ференцировать AT к ВКЧС от AT к вирусу диареи КРС; при получении положительных ре­зультатов необходимо сочетать его с РН.

ИФА в непрямой модификации. На миллипоровские фильтры (тип ОН, диаметр пор 0,3 мм), диаметр которых равен 0,6 см, смоченные р-ром АГ ВКЧС, наносят свиные сыво­ротки. Затем фильтры инкубируют в р-ре кроличьего IgG (против IgG свиньи), меченого пероксидазой хрена RZ=3,0. Активность связанной пероксидазы определяют в р-ре субстрата 3,3-диаминобензидина. Опытные образцы окрашивались в коричневый цвет, контрольные оставались бесцветными. Реакция громоздкая.

ELISA. Разработан метод определения AT к ВКЧС на микроплатах, поддающийся ав­томатическому анализу. Описана методика получения очищенного и концентрирован­ного АГ для теста ELISA из шт. Альфорт, размноженного в культуре клеток РК-15. Резуль­таты ELISA и РН близки. ELISA легок в выполнении, дешев, позволяет быстро иссле­довать большое количество образцов, высокочувствителен и рекомендован в качестве мето­да оценки при крупномасштабных обследованиях.

С использованием иммуноглобулинов баранов, инфицированных ВКЧС, разработана технология изготовления ИФ-конъюгатов, пригодных для выявления вирусного АГ в пато­логическом материале. При постмортальной диагностике вирус выявляется со 100% эффек­тивностью без биологического накопления. При экспериментальном заражении вирус в про­бах мочи и крови обнаруживали через 8-10 ч, при контактном заражении - через 72-96 ч. Положительные результаты при индикации ВКЧС в объектах ветеринарного надзора (зерно, почва, вода) получены при концентрации вируса, превышающей 100 ИД. Пока­зано успешное применение ИФА для выявления ВКЧС в культуре клеток РК-15.

Описано получение монАТ для диагностики КЧС на мышах линии BALB/c 4-кратно иммунизированных ВКЧС (шт.Альфорт). Клетки селезенки мышей "сливали" с миеломными клетками Sp2/0. Полученные гибридомы культивировали в 20% среде ДМЕМ Ну-Нт при 37°С в атмосфере 5% С0₂. Продуцирующую специфические AT культуру дважды субклонировали и после определения изотипа AT инокулировали интраперитонеально мышам BALB/c. Образующаяся асцитная жидкость содержала высокие концентрации монАТ, кото­рые после соответствующей очистки конъюгировали пероксидазой хрена.

Разработан способ изготовления иммуноферментных коньюгатов для ИФА с использо­ванием монАТ к ВКЧС с сохранением активности фермента и высокой специфической активностью иммуноглобулина, а также метод флюоресцирующих зондов (МФЗ), ко­торый не уступал по чувствительности и специфичности МФА. Разработан метод выявления ВКЧС методом молекулярной гибридизации и ПЦР(2)(4)