Разработка средств обнаружения и диагностики
Во время вспышки 1997 года анализ ингибирования гемагглютинации, стандартный для серологического определения инфекции гриппа у человека, показал низкую чувствительность при определении антител к вирусу птичьего гриппа. В связи с этим, для определения антител к вирусу птичьего гриппа у человека был предложен более чувствительный метод микронейтрализации и Н5 специфический непрямой ELISA (иммуноферментный анализ). Чувствительность и специфичность этих методов была сравнима и, кроме того, значительно увеличивалась при сочетании с Вестерн-блотом. Максимальная чувствительность (80%) и специфичность (96%) при определении анти Н5 антител у взрослых в возрасте от 18 до 59 лет достигалась при применении микронейтрализации в сочетании с Вестерн блотом, а максимальная чувствительность (100%) и специфичность (100%) при определении анти Н5 антител в сыворотке детей моложе 15 лет достигалась при применении ELISA в сочетании с Вестерн блотом. Этот алгоритм может использоваться при проведении сероэпидемиологических исследований вспышек птичьего гриппа H5N1 (46).
Было также показано, что высокопатогенные нейротропные варианты вируса птичьего гриппа H5N1 могут быть быстро выделены на мышах (47).
Кроме того, еще в 1995 году для быстрого определения последовательности сайта расщепления гемагглютинина, маркера потенциала вирулентности вирусов птичьего гриппа, была использована RT-PCR (полимеразная цепная реакция). Эта методика в сочетании с сиквенсом сайта расщепления гемагглютинина может служить в качестве быстрого и чувствительного метода оценки потенциальной вирулентности вирусов птичьего гриппа. Раннее обнаружение связанных с вирулентностью последовательностей на сайте расщепления гемагглютинина в полевых изолятах вируса поможет лучше контролировать грипп среди огромной популяции домашней птицы (48).
В дальнейшем был разработан простой молекулярный метод быстрого генотипирования для мониторинга внутренних генов циркулирующего вируса гриппа А. Стратегия субтипирования вируса была протестирована вслепую на 10 контрольных вирусах каждого субтипа H1N1, H3N2 и H5N1 (всего на 30) и обнаружила высокую эффективность. Стандартизованный метод генотипирования использовался для идентификации источника внутренних генов 51 вируса гриппа А, выделенного от людей в Гонконге в ходе вспышек 1997-1998 годов и сразу после них. Эта же методика использовалась для характеристики внутренних генов двух изолятов вируса птичьего гриппа H9N2, полученных в Гонконге в 1999г. (49)
Позднее был разработан real-time reverse transcriptase PCR (RRT-PCR) анализ для быстрого определения вируса гриппа А и субтипов Н5 и Н7 вируса гриппа А. В этом анализе используется одностадийный способ определения и флуоресцентные зонды. Предел определения - около 1000 копий мишени-РНК. С помощью этого метода можно определить 0,1 50%-ную инфекционную дозу для куриных эмбрионов. Для анализа субтипов вируса гриппа А предел определения - 103-104 копии мишени-РНК. Чувствительность и специфичность данного метода напрямую сравнивалась со стандартными методиками для определения вируса гриппа: выделение гриппа на куриных эмбрионах и субтипирование гемагглютинина в реакции ингибирования гемагглютинации. Сравнение проводилось на 1550 трахеальных и клоачных мазках от различных видов птиц и мазков, взятых из окружающей среды на рынках живой птицы в Нью-Йорке и Нью-Джерси. Результаты RRT-PCR коррелировали с результатами выделения гриппа на куриных эмбрионах в 89% образцов. Остальные образцы были положительными при определении только одним из методов. В целом чувствительность и специфичность Н7- и Н5-специфичных анализов была сходна с методом выделения вируса на куриных эмбрионах и реакции ингибирования гемагглютинации (50).
Лечение заболевания
Исследования, проводимые до сих пор, подтверждают, что назначение лекарств, разработанных для штаммов человеческого гриппа, будут эффективны и в случае инфекции птичьего гриппа у человека, однако не исключена возможность, что штаммы гриппа могут стать резистентными к таким лекарствам и эти лекарства станут неэффективными.
Было обнаружено, что выделенный вирус чувствителен к амантадину и римантадину, ингибирующим репродукцию вируса гриппа А и применяемым в терапии человеческого гриппа (51). Кроме того, был исследован ряд других препаратов. Ингибитор нейраминидаз занзивир ингибировал репликацию вирусов на клетках почек хомяков в анализе вирусного урожая (50% эффективная концентрация, 8,5-14,0 mM) и ингибировал активность вирусной нейраминидазы (50% ингибирующая концентрация 5-10 nM). Интраназальное введение занзивира дважды в день (50 и 100 mg/kg веса тела) полностью защищало мышей от смерти. В дозе 10 mg/kg веса занзивир полностью защищал мышей от инфицирования вирусом H9N2 и увеличивал продолжительность жизни и количество выживших мышей, инфицированных вирусами H6N1 и H5N1. Во всех исследованных дозах занзивир значительно уменьшал титры вируса в легких и полностью блокировал распространение вируса в мозг. Таким образом, занзивир является эффективным при лечении птичьего гриппа, который может быть перенесен на млекопитающих (52).
Орально вводимый ингибитор нейраминидазы RWJ-270201 был протестирован в параллели с занамивиром (zanamivir) и озелтамивиром (oseltamivir) на панели вирусов птичьего гриппа на ингибирование нейраминидазной активности и репликации в тканевых культурах. Затем эти агенты были протестированы на защиту мышей против летальных инфекций H5N1 и H9N2. In vitro, RWJ-270201 был наиболее эффективным против всех девяти субтипов нейраминидазы. RWJ-270201 (концентрация 50% ингибирования от 0,9 до 4,3 nM) превосходил занамивир и озельтамивир карбоксилат по ингибированию нейраминидазы. RWJ-270201 ингибировал репликацию вируса птичьего гриппа как евразийской, так и американской линии на клетках MDCK (концентрация 50% эффективности от 0,5 до 11,8 mM). Мыши, которым ежедневно давали RWJ-270201 из расчета 10 mg на кг веса были полностью защищены против контрольного заражения летальной дозой вирусов A/Hong Kong/156/97 (H5N1) и A/quail/Hong Kong/G1/97 (H9N2). Как RWJ-270201, так и озельтамивир значительно уменьшали титры вирусов в легких мышей при дневных дозах от 1,0 до 10 mg/kg и защищали распространение вируса в мозг. Когда лечение начиналось через 48 часов после экспозиции вирусом H5N1, 10 mg RWJ-270201/kg веса ежедневно защищали 50% мышей от гибели. Эти результаты подтвердили, что RWJ-270201 эффективен против вируса птичьего гриппа по крайней мере также, как и занамивир или озельтамивир и потенциально может использоваться в клинической практике для лечения птичьего гриппа при переносе его от птиц к человеку (53).