Ii. діагностика хвороби ньюкасла
Діагноз на хворобу Ньюкасла встановлюють на підставі епізоотологічних даних, клінічних ознак, результатів патолого-анатомічного розтину, серологічних та вірусологічних лабораторних досліджень, включаючи виділення та ідентифікацію збудника з наступним визначенням його патогенності.
Для дослідження направляють свіжі трупи (не пізніше 10 год після загибелі) або хвору птицю (не менше 5 голів з пташника, вигулу, вольєра, партії або населеного пункту), внутрішні органи (легені з трахеєю, селезінку, печінку, серце, кишечник, включаючи вмістище, нирки), голову, головний мозок (у замороженому вигляді або в 50 % розчині гліцерину), ексудат черевної порожнини, 25 проб сироваток крові від птиці кожного пташника / населеного пункту. Відбирають мінімум 20 мазків з трахеї та клоаки, проби посліду тощо. У випадку, коли в господарстві утримується невелика кількість птиці (40‑60 голів), то проби для дослідження відбираються від всієї птиці.
Також направляють інкубаційні яйця та завмерлі ембріони.
Транспортують патологічний матеріал у термосі (ємності) з льодом, в герметично закритій тарі.
Зразки біоматеріалу від птиці можна зберігати до 2 діб за температури 4 оС або до 7 діб за температури – 18‑2 оС, для більш тривалого зберігання їх заморожують за температури ‑ 70 оС.
Сироватка крові може зберігатись за температури 4 оС до 5 діб, після чого її заморожують до температури – 18‑2 оС.
Трахеальні та клоакальні змиви доставляють до лабораторії з дотриманням холодового режиму: негайне охолодження після відбору проб з використанням пакетів льоду або холодоелементів з гелю та транспортування в межах 24 год до державної лабораторії ветеринарної медицини.
Для проведення дослідження методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) допускається зберігання відібраного матеріалу від птиці упродовж 24 год за температури від 2 до 8 оС або до 7 діб за температури – 18‑2 оС.
Методи дослідження
Лабораторні дослідження на хворобу Ньюкасла проводять в державних акредитованих лабораторіях ветеринарної медицини.
Експрес-тестами виявлення вірусу хвороби Ньюкасла є:
- метод флюорестуючих антитіл на повздовжніх зрізах трахеї (реакція імунофлюоресценції);
- пероксідазний метод на зрізі мозку з використанням антитіл;
- виявлення антитіл у невакцинованої птиці (реакція затримки гемаглютинації - РЗГА) або твердофазний імунноферментний аналіз - ІФА для виявлення антитіл до вірусу хвороби Ньюкасла;
-метод ПЛР.
Виділення вірусу на курячих ембріонах або лабораторних тваринах з наступною його ідентифікацією.
Визначення вірулентності штаму за індексом інтрацеребральної патогенності та індексом внутрішньовенної патогенності.
У випадку виявлення у птиці антитіл до вірусу субтипу 1 (PMV-1) проводять повне епізоотичне обстеження та лабораторні дослідження біоматеріалу.
При отриманні позитивного результату (ПЛР, вірусологічний) патолого‑біологічний матеріал та ізоляти з вірусом хвороби Ньюкасла направляють у Державний науково-дослідний інститут з лабораторної діагностики та ветеринарно-санітарної експертизи для підтвердження.
Наявність вірусу хвороби Ньюкасла визнається, коли вірус птиці був виділений та ідентифікований як такий або характерна для такого типу вірусу вірусна РНК була виявлена в птиці чи при дослідженні одного з продуктів птиціництва.
Діагноз хвороби Ньюкасла птиці вважається встановленим при наявності одного чи кількох критеріїв:
- клінічних ознак захворювання,
- характерних патолого-анатомічних змін
- виділення вірусу хвороби Ньюкасла та визначення його вірулентності або якщо виявлено наявність множинних базових амінокислот, було встановлено на рівні C‑термінальної функції протеїну F2, а також фенілаланіну на рівні залишку 117 N‑термінальної фракції протеїну F1.
Під терміном "множинні базові амінокислоти" мають на увазі наявність мінімум трьох амінокислот, відповідних аргініну або лізину між залишками 113 та 116. За відсутності показника множинних базових амінокислот необхідно характеризувати виділений вірус шляхом визначення індексу інтрацеребральної патогенності. При цьому нумерація залишків амінокислот ведеться, починаючи з N-термінальної фракції амінокислотної частки ділянки нуклеотидної частки (ділянки) гена FO, а залишки 113-116 відповідають залишкам від - 4 до - 1 від ділянки кліважу.
Метод виділення вірусу
Сутність методу полягає у виявленні патогенної дії вірусу на ембріони курей, його гемаглютинуючих властивостях с послідуючою ідентифікацією серологічним методом, визначенні титру та вірулентності виділеного вірусу.
Матеріали та обладнання: термостат з температурою 37‑38 оС; центрифуга лабораторна з частотою обертів 3000 об/хв.; стакани центрифужні ємкістю 50 та 100 см3; ваги лабораторні з похибкою не більше 0,01 г; подрібнювач тканин; овоскоп; колби конічні скляні ємкістю 10, 15 та 20 см3; піпетки пастерівські або піпетки скляні вимірювальні ємкістю 1, 2, 5 і 10 см3; ступка порцелянова; шприци з голками; скло кварцове; натрій хлористий 0,87 %‑вий розчин (фізіологічний) з рН 7,2‑7,4; натрію гідроокис 3 % вий розчин або інші дезінфікуючі розчини; натрій лимонно трьохзаміщений 5 %‑вий розчин; йод 5 %‑вий розчин; антибіотики (пеніцилін, стрептоміцин, неовітін); парафін; ембріони курей 9‑10‑добового віку; еритроцити курей у фізіологічному розчині, 1 %‑ва суспензія, яку готують наступним чином: кров беруть у птиці або курей у віці старше 6 міс з підкрильцевої вени в колбу з фізіологічним розчином лимоннокислого натрію. Отриману кров відмивають фізіологічним розчином, піддають центрифугуванню з частотою обертання 1500 об / хв упродовж 10 хв. З осаду відмитих еритроцитів готують 1 %‑ву суспензію на фізіологічному розчині і зберігають не більше 5 діб за температури 4 °С.
Підготовка до дослідження. Проби патологічного матеріалу достають з гліцеринового розчину, трикратно ополіскуючи стерильним фізіологічним розчином і гомогенізують у стерильному фізіологічному розчині в співвідношенні 1 : 5 за допомогою подрібнювача тканин або подрібнюють у ступці з кварцовим склом, центрифугують з частотою обертів 1500‑2000 об / хв упродовж 20 хв.
Супернатант відбирають піпеткою і обробляють упродовж 30 хв за кімнатної температурі антибіотиками: 1000‑2000 ОД / см3 пеніциліну в 500‑1000 ОД / см3 стрептоміцину для придушення сторонньої мікрофлори.
Проведення дослідження. Супернатант досліджують у крапельній реакції гемаглютинації з 1 %‑вою суспензією еритроцитів курей.
Для дослідження однієї проби матеріалу заражають не менше 10 ембріонів 9‑10‑добового віку. Контролем служать 3‑5 незаражених ембріонів.
Перед зараженням ембріони попередньо овоскопують, відзначаючи межу пуги. Збоку ембріона між кровоносними судинами відзначають ділянку для проколу шкарлупи і інокуляції дослідного матеріалу. Шкарлупу з боку пуги і місце проколу дезінфікують і обробляють фламбуванням. У центрі повітряного простору і в місці введення матеріалу роблять пробійником отвори, потім через бічний отвір вводять 0,2 см3 дослідного матеріалу на глибину 2‑3 мм в алантоїсну порожнину. Після зараження ембріонів отвори в шкаралупі заливають парафіном. Заражені і контрольні ембріони інкубують в термостаті упродовж 120 год за температури37 °С.
У процесі інкубація ембріони овоскопують два рази на добу через 12 год. Ембріони, загиблі упродовж перших 24 год, знищують, інші зберігають в холодильнику за температури 4 °С.
Через 72 год інкубації п'ять ембріонів охолоджують за температури4 °С упродовж 12‑18 год, решту ‑ п'ять інкубують до 120 год, а потім охолоджують за 4 оС упродовж 16‑18 год.
Перед оглядом ембріонів шкарлупу над повітряним простором дезінфікують 5 %‑вим розчином йоду або фламбують, скривають і збирають ембріональну (алантоїсно-амніотичну) рідину в стерильні пробірки від кожного ембріона окремо. Велогенні штами вірусу вбивають курячі ембріони через 32‑60 год інкубації, мезогенні ‑ через 60‑90 год, лентогенні- через 100 год і більше.
Взяті з кожного ембріона зразки екстраембріональної рідини перевіряють на гемаглютинуючих активність вірусу в крапельної реакції гемаглютинації (РГА), яку ставлять на склі шляхом змішування краплі екстраембріональної рідини з краплею 1 %‑вої суспензії еритроцитів курей.
За відсутності РГА ембріональну рідину відібрану в кількості 1 см3 від кожного зараженого ембріона (не менше 5), об'єднують та повторно заражають курячі ембріони 9‑10‑добового віку (не менше 10 ембріонів).
Виділення вірусу проводять упродовж 3‑5 пасажів на курячих ембріонах, перевіряючи в кожному пасажі ембріональну рідину на наявність гемаглютиніну в крапельній РГА. Якщо титри гемаглютинінів низькі, проводять ще 2‑3 додаткових пасажу.
Обробка результатів. Пробу дослідного матеріалу вважають негативною, якщо у всіх проведених пасажах не буде виявлено гемаглютинації еритроцитів і патогенної дії вірусу (загибель ембріонів).
За наявності гемаглютинації еритроцитів або загибелі ембріонів проводять ідентифікацію виділеного вірусу, визначають титр і вірулентність вірусу на ембріонах курей.