Микологическое исследование
Для микологического исследования берут пробы от только что погибших или живых рыб. В замороженном виде их можно хранить до 3-х суток, а в консерванте до 2-х суток.
Подтверждение или исключение микозной природы болезни осуществляется с помощью следующих методов:
- микроскопическое исследование – наиболее важный метод обнаружения и исследования грибов, позволяющий установить наличие гриба, его локализацию, а иногда и вид;
- гистологическое исследование – метод исследования пораженной ткани при микозах, является основным методом диагностики, так как многие грибы невозможно культивировать на искусственных питательных средах;
- постановка биопробы.
Культивирование грибов позволяет изучить морфологию колоний, типичные формы спороношения, сохранить культуры и получить заразный агент для биопробы.
Бактериологическое исследование
Исследование основано на бактериоскопическом и серологическом методах исследования.
Бактериоскопический метод исследования позволяет обнаружить в патматериале бактерии и ориентировочно диагностировать заболевание (микобактериоз, вибриоз). Бактериологический метод исследования имеет наиболее важное значение, так как позволяет получить чистую культуру микробов, изучить их морфо-культуральные свойства, биохимические свойства, определить вирулентность и чувствительность к антибиотикам, что особенно важно при выборе лечебных препаратов.
Серологический метод применяют при иммунологических исследованиях: дополнительном типировании возбудителя, выявлении специфических антител в сыворотке крови больных рыб.
Вирусологическое исследование
Исследование включает культивирование на культуре клеток и идентификация вируса, постановка биопробы. Для культивирования вирусов используют первично трипсинизированную культуру клеток или используют перевиваемые культуры клеток, обладающих бесконечной потенцией роста in vitro (FHM – из тканей хвостового стебля жирноголового гольяна, RIG2 – из гонад радужной форели, EPC – из клеток оспенных разростов на коже карпа). Перевиваемые культуры выбирают исходя из предполагаемой природы вируса. Первично трипсинизированную культуру клеток готовят из гонад самок рыб II-й и III-й стадии зрелости по шкале Киселевича. Для трипсинизации используют 0,5 %-ный раствор трипсина вместо 0,25 %, так как работа ведется при комнатной температуре. Степень поражения клеточного монослоя выражают в крестах (25 % – +; 50 % – ++; 75 % – +++; 100 % – ++++).
Для идентификации вирусов используют несколько взаимодополняющих методов: электронную микроскопию, изучение физико-химических свойств вируса, обнаружение характерных морфологических изменений в зараженных клетках, серологические методы (РН, РП, РСК и др.).
Биологическая проба
Биопроба ставится для окончательного установления диагноза. При постановке ее с целью определения патогенности возбудителя применяют чистые культуры бактерий, вирусов, грибов. Кроме того, применяют нативные суспензии и взвеси, приготовленные из различных органов и тканей, естественно больных или подозреваемых в заражении рыб. Биопробу ставят в аквариумах, ваннах или бассейнах, создавая в них оптимальные условия для жизни рыб и размножения возбудителей болезни. Для биопробы берут заведомо здоровую рыбу того же вида и возраста. Наблюдения ведут ежедневно, учитывая количество погибших рыб, клинические изменения и характер патологоанатомических изменений. Длительность опыта определяется с учетом инкубационного периода.
Заражение рыб проводят следующими способами: per os; подкожно; внутримышечно; внутрибрюшинно; контактным методом; орошением жабр или выдерживанием рыб в воде, содержащей возбудителя; скарифицированием кожи.
Дозу вводимого патологического материала в каждом конкретном случае определяют титрованием на восприимчивых рыбах.
Биопроба считается положительной, если у 80 % зараженных рыб проявляется весь комплекс клинических признаков и патологоанатомических изменений болезни и погибает не менее 50 % больных рыб, при выделении от погибших рыб исходных возбудителей.