На микробиологическое исследование

Леч., пед. ф-ты 2006

ЗАНЯТИЕ 14

Тема: Микробиологическая диагностика стафилококковых инфекций.

Цель: На основе знаний биологии стафилококков и особенностей их взаимодействия с макроорганизмом уметь обосновать тактику микробиологической диагностики, профилактику и терапию вызываемых ими заболеваний.

Знать:

1. Особенности биологии стафилококков, определяющие их роль в инфекционной патологии человека.

2. Патогенез развития стафилококковых инфекций.

3. Материал и методы микробиологической диагностики стафилококковых инфекций.

4. Специфическую профилактику и терапию стафилококковых инфекций.

5. Тактику этиотропной антимикробной химиотерапии на современном этапе.

Уметь:

1. Провести забор и посев отделяемого из носа с целью выявления бактерионосительства S.aureus.

2. Готовить фиксированные мазки из гноя, чистых культур, окрашивать их по Граму, микроскопировать их и интерпретировать полученные результаты.

3. Учесть и оценить результаты метода секторных посевов исследуемого материала.

4. Учесть и оценить результаты изучения биохимических свойств.

5. Учесть и оценить результаты определения метициллинорезистентности и антибиотикограммы культур стафилококков.

6. Учесть и оценить результаты фаготипирования стафилококков.

7. Определить видовую принадлежность исследуемой культуры.

8. Заполнить бланк-направление и бланк-ответ из бак.лаборатории.

Контрольные вопросы:

1. Классификация и морфобиологические свойства стафилококков.

2. Факторы вирулентности стафилококков.

3. Экология, эпидемиология и особенности патогенеза стафилококковых инфекций.

4. Роль стафилококков в развитии внутрибольничных инфекций (ВБИ).

5. Материал и методы микробиологической диагностики стафилококковых инфекций.

6. Специфическая профилактика и терапия стафилококковых инфекций.

7. Этиотропная антимикробная химиотерапия стафилококковых инфекций. Особенности лечения заболеваний, вызываемых MRSA/MRSE.

8. Роль неспецифической профилактики в предупреждении ВБИ стафилококковой этиологии.

9. Особенности неспецифической профилактики ВБИ, вызываемых MRSA/MRSE.

Задания, выполняемые в ходе занятия (УИРС):

1. Провести бактериологическое исследование патологического материала (гноя) с целью установления этиологии заболевания:

1.1. Приготовить препарат из гноя, взятого от больного с абсцессом в предверии носа, окрасить по Граму, промикроскопировать.

1.2. Оценить результаты посева того же гноя на желточно-солевой агар (ЖСА) и кровяной агар (КА) методом секторных посевов.

1.3. Приготовить препарат из агаровой культуры, выделенной из гноя того же больного, окрасить по Граму, промикроскопировать.

1.4. Учесть и оценить результаты посева исследуемой культуры на «пестрый ряд».

1.5. Учесть и оценить результаты фаготипирования исследуемой культуры.

1.6. Учесть и оценить результаты определения метициллинорезистентности исследуемой культуры.

1.7. Определить антибиотикограмму исследуемой культуры.

1.8. Полученные результаты занести в протокол и сделать вывод; заполнить бланк-направление и бланк-ответ из бак.лаборатории.

2. Провести посев отделяемого из носа на ЖСА методом «штрих с площадкой» с целью выявления бактерионосительства S.aureus.

3. Ознакомиться и описать в протоколе био.препараты, указав, что они содержат, для чего и как применяются: стафилококковый анатоксин, стафилококковый иммуноглобулин, лечебный стафилококковый бактериофаг, типовые стафилококковые бактериофаги.

Методические указания к выполнению исследовательского задания:

1. Проведите бактериологическое исследование по обнаружению и выделению предполагаемого возбудителя из гноя, для чего:

1 этап. Приготовьте препарат-мазок из гноя, взятого от больного с закрытым абсцессом в предверии носа, окрасьте по Граму и промикроскопируйте. Результаты исследования внесите в протокол и сформулируйте ответ.

Для приготовления препарата на предметное стекло нанесите каплю физиологического раствора, внесите в нее гной и равномерно распределите его петлей. Препарат высушите, зафиксируйте в смеси Никифорова в течение 20 мин. и окрасьте по Граму.

В биоматериале стафилококки – это грамположительные мономорфные кокки диаметром 0,5-1,5 мкм, которые располагаются одиночно, парами и небольшими группами среди лейкоцитов. Это позволяет сделать вывод о выявлении грамположительных кокков и продолжить исследование.

Исследуемый материал засевают стандартной бактериологической петлей на чашки с КА и ЖСА методом секторных посевов (метод Gould). Вначале делают 30-40 штрихов в секторе I, затем прожигают петлю и делают 4 штриха из сектора I в сектор II и таким же способом из сектора II в III, из III - в IV сектор, каждый раз прожигая петлю (приложение 1, рис. 1).Чашки инкубируют при 37⁰ в течение 24-48 ч.

2 этап. Оцените результаты посева гнойного материала того же больного на средах ЖСА и КА, дайте характеристику выросшим колониям.

Для количественного учета подсчитывают выросшие колонии и определяют количество соответствующих микроорганизмов в 1 мл исследуемого материала (приложение 1, таблица). Интерпретация результатов: величина ³ 10⁵ КОЕ/мл свидетельствует об этиологической роли микроорганизмов.

При наличии в патологическом материале стафилококков рост будет наблюдаться одновременно на ЖСА и КА. На ЖСА стафилококки растут в виде круглых, диаметром 1-3 мм, непрозрачных, выпуклых, блестящих, пигментированных колоний, имеющих ровный край, гомогенную структуру и маслянистую консистенцию. Вокруг колоний стафилококков, обладающих лецитиназной активностью, образуется радужный венчик. На КА может наблюдаться гемолиз, хорошо видимый в проходящем свете. Для получения чистой культуры 2-3 характерные колонии пересевают на скошенный агар и инкубируют при 37^о в течение 16-18 ч.

3 этап. Изучите характер роста пиокультуры на скошенном агаре, приготовьте фиксированный препарат, окрасьте по Граму и промикроскопируйте. Дайте заключение.

В препарате из суточной культуры стафилококки образуют характерные скопления, напоминающие гроздья винограда.

В том случае, если выделенная культура чистая, приступают к дальнейшему исследованию. Для определения родовой принадлежности и дифференциации от рода Micrococcus определяют способность к росту при 45⁰и при высокой концентрации NaCl (10-12%).

Для определения видовой принадлежности определяют коагулазную активность и способность окислять углеводы при посеве на «пестрый ряд» (см занятие №5,6 и таблицу №1).

В случае выделения S.aureus для определения источника и путей распространения инфекции проводится фаготипирование культуры (см занятие №8).

Для этиотропной терапии определяют метициллинорезистентность исследуемой культуры (см занятие №12) и в случае выделения MSSA/MSSE определяют антибиотикограмму методом дисков (см занятие №5,6).

4 этап. Учтите результаты посева культуры на комплекс питательных сред, определите видовую принадлежность культуры, метициллинорезистентность и в случае необходимости фаговар и антибиотикограмму.

Заполните бланк-направление и бланк-ответ из бак.лаборатории (см. приложение 2).

Таблица №1

Дифференцирующие свойства видов рода Staphylococcus, наиболее часто

встречающихся в клиническом материале

№№	Виды	Плазмоко- агуалаза	Ман-нит	Маль-тоза	Лакто-за	Сахаро-за	Ксило-за	Трега-лоза
	S.aureus	+	+	+	+	+	-	+
	S.intermedius	+	+	-	d	+	-	+
	S.hyicus	+	-	-	+	+	-	+
	S.epidermidis	-	-	+	d	+	-	-
	S.saprophyticus	-	d	+	d	+	-	+
	S.xylosus	-	d	+	d	+	+	+
	S.haemolyticus	-	d	+	d	+	-	+
	S.warneri	-	d	(+)	-	+	-	+
	S.hominis	-	-	+	d	(+)	-	d
	S.gallinarum	-	+	+	d	+	+	+

Обозначения:

+ 90% и более штаммов положительные;

- 90% и более штаммов отрицательные;

(+) 80-89% штаммов положительные;

d 11-89% штаммов положительные;

П. Проведите посев отделяемого из носа на ЖСА методом «штрих с площадкой» с целью выявления бактерионосительства S. aureus.

Одной из мер профилактики ВБИ является выявление бактерионосителей S.aureus среди медицинского и обслуживающего персонала ЛПУ с последующей санацией. Материалом для обязательного исследования является отделяемое передних отделов носа; исследование отделяемого из зева проводят при наличии воспалительных процессов в зеве. Забор материала из передних отделов носа осуществляется одним стерильным сухим ватным тампоном, который сначала вводят в один, а потом в другой носовой ход, не касаясь крыльев носа снаружи. Посев исследуемого материала на половину чашки Петри с ЖСА, элективной средой для выделения стафилококков, осуществляют не позже 2-х ч после забора методом “штрих с площадкой”. Чашки инкубируют 24 –48 ч при 37°С.

При наличии в посевах характерных для стафилококков колоний их отсевают на скошенный агар для последующего определения видовой принадлежности и ориентировочно определяют массивность их роста в крестах:

++++ - сливной рост;

+++ - сплошной рост изолированных колоний;

++ - значительный рост (до 100 колоний);

+ - единичные колонии (10-25 колоний).

Выделение от обследуемого культуры S.aureus в количестве 10³ и больше микробных клеток, снимаемых с тампона (сливной и сплошной рост при посеве на ЖСА), является показателем высокой обсемененности слизистых носа. При этом происходит выделение S.aureus во внешнюю среду как при различных экспираторных актах, так и при спокойном дыхании. Следовательно, обследуемый является бактерионосителем S.aureus и представляет потенциальную опасность.

Для профилактики ВБИ проводят санацию бактерионосителей. В тех случаях, когда не удается добиться санацией снижения или полного избавления от носительства стафилококка, необходимо правильное ношение маски, закрывающей рот и нос. При этом необходимо иметь график ношения масок и проводить их смену каждые 3 ч. При отсутствии положительных результатов при лечении хронических воспалительных процессов ВДП медицинских работников переводят на другую работу.

2. Ознакомьтесь и опишите в протоколе биопрепараты, указав, что они содержат, для чего и как применяются (стафилококковый анатоксин, стафилококковый иммуноглобулин, лечебный стафилококковый бактериофаг, типовые стафилококковые бактериофаги).

Вопросы для самоконтроля:

1. Назовите типовое проявление стафилококковой инвазии.

2. Обоснуйте опасность генерализации стафилококковой инфекции при локализации пиогенного процесса в зоне носогубного треугольника.

3. Назовите правила забора и доставки материала с целью диагностики стафилококковых инфекций.

4. Назовите особенности бактериологического исследования на стафилококки.

5. Обоснуйте необходимость использования метода секторных посевов при диагностике стафилококковых инфекций.

6. Обоснуйте какой объем крови необходимо для выделения гемокультуры стафилококков и тактику ее посева на 1 этапе бак. метода.

7. Назовите и обоснуйте сроки выдачи результатов бактериологического исследования при выделении пио- и гемокультуры стафилококков.

8. Какое значение имеет бактерионосительство стафилококков в условиях ЛПУ.

9. Обоснуйте тактику антибиотикотерапии в случае выделения метициллинорезистентных (MRSA, MRSE) и метициллиночувствительных (MSSA, MSSE) штаммов стафилококков.

10. Назовите основные меры профилактики ВБИ стафилококковой этиологии.

11. Назовите особенности профилактики ВБИ, вызываемых MRSA, MRSE.

Литература:

Учебники:

1. Борисов Л. Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. – М.: ООО «МИА», 2002. – С.352-359 .

2. Поздеев О. К. Медицинская микробиология / Под ред. акад. РАМН В. И. Покровского. - М.: ГЭОТАР Медицина, 2001. – С.281-287 .

Лекции по микробиологии.

Тесты.

Приложение №1

Рис. 1 Метод секторных посевов (метод Gould)

Показатели микробной обсемененности жидких материалов в зависимости от числа колоний,

выросших на секторах плотной питательной среды

Кол-во м/о в 1 мл материала	Число колоний
I сектор	II сектор	III сектор	IV сектор
< 10³	1-6
10³	8-20
5 х 10³	20-30
10⁴	30-60
5 х 10⁴	70-80
10⁵	100-150	5-10
5 х 10⁵	> 150	20-30
10⁶	не сосчитать	40-60
5 х 10⁶	не сосчитать	100-140	10-20
10⁷	не сосчитать	не сосчитать	30-40
5 х 10⁷	не сосчитать	не сосчитать	60-80	единичные
10⁸	не сосчитать	не сосчитать	80-140	до 25

Приложение №2

Медицинская документация

Форма № 204/у

Утв. МЗ СССР 04.10.80 № 1030

НАПРАВЛЕНИЕ №_______

на микробиологическое исследование

«_____»____________________200__г. ____________час.__________мин.

дата и время взятия материала

В ______________________________________________________лабораторию

Вид исследования ___________________________________________________

Ф. И. О. ____________________________________________________Возраст__________________

Отделение ___________

Диагноз, дата заболевания______________________________________________________________

Показания к обследованию: больной, переболевший, реконвалесцент, бактерионоситель, контактный, профобследование (нужное подчеркнуть)

Материал: кровь, мокрота, кал, дуоденальное содержимое, пунктат, спинномозговая жидкость, раневое отделяемое, гной, выпот, секционный материал, мазок (подчеркнуть, вписать) ____________

Должность, фамилия, подпись лица, направляющего материал _______________________________

____________________

Медицинская документация

Форма № 239/у

Утв. МЗ СССР 04.10.80 № 1030

РЕЗУЛЬТАТ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ №______

«_____»____________________200__г.

дата взятия биоматериала

Ф. И. О. ____________________________________________________Возраст__________________

Отделение ___________

При исследовании_____

указать материал и результат