Учтите и оцените результаты РСК с гонококковым антигеном и сыворотками обследуемых.

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального

образования «Красноярский государственный медицинский университет

имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого»

Министерства здравоохранения Российской Федерации

ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России

Кафедра микробиологии им. доц. Б.М. Зельмановича

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ДЛЯ ОБУЧАЮЩИХСЯ

по дисциплине «Микробиология, вирусология»

для специальности060101 – Лечебное дело (очная форма обучения)

К ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗАНЯТИЮ № 10

ТЕМА: «Реакция связывания комплемента. Реакции с участием меченых антител: иммуноферментный анализ (ИФА), реакция иммунофлюоресценции (РИФ)»

Утверждены на кафедральном заседании

протокола № ___ от «___» _____________20__ г.

Заведующий кафедрой:

к.б.н., доцент ________________Перьянова О.В.

Составитель:

к.б.н., доцент ________________Перьянова О.В.

Красноярск

Занятие № 10.

Тема: «Реакция связывания комплемента. Реакции с участием меченых антител: иммуноферментный анализ (ИФА), реакция иммунофлюоресценции (РИФ)».

2. Форма организации учебного процесса:практическое занятие

Значение изучения темы.

Реакция связывания комплемента (РСК), разработанная Ж. Бордэ и О. Жангу в 1901 г., является одной из серологических реакций для определения специфичности и количества антигена или антител. Она отличается высокой специфичностью, чувствительностью и применяется для серодиагностики бактериальных, риккетсиозных, микоплазменных и вирусных инфекционных заболеваний. Универсальность данной реакции состоит в том, что она может быть использована для определения антигенов любого происхождения, причем как корпускулярных, так и растворимых.

Реакции с участием меченных антител: иммуноферментный анализ, реакция иммунофлюоресценции являются современными серологическими реакциями, широко применяемые в микробиологической диагностике инфекционных заболеваний.

4. Цели обучения:

- общая: обучающийся должен обладать: способностью и готовностью анализировать социально-значимые проблемы и процессы, использовать на практике методы гуманитарных, естественнонаучных, медико-биологических и клинических наук в различных видах профессиональной и социальной деятельности (ОК-1); способностью и готовностью к логическому и аргументированному анализу, к публичной речи, ведению дискуссии и полемики (ОК-5), способностью и готовностью проводить и интерпретировать результаты современных лабораторно-инструментальных исследований (ПК-5), способностью и готовностью изучать научно-медицинскую информацию, отечественный и зарубежный опыт по тематике исследования (ПК-31).

- учебная:

знать:

- сущность иммунологических методов диагностики инфекционных заболеваний, области их применения, принципы интерпретации полученных результатов;

- реакцию связывания комплемента, особенности постановки, практическое использование;

- сущность РИФ, разновидности, методику постановки, практическое использование;

- сущность ИФА, методику постановки, практическое использование.

уметь:

- соблюдать технику безопасности и правила работы с материалом, представляющим биологическую опасность;

- обосновать выбор материала и методов микробиологической диагностики с учетом биологии возбудителя, патогенеза и основных клинических проявлений заболевания; интерпретировать полученные результаты;

- учесть и оценить результаты РСК;

- учесть и оценить результаты РИФ;

- учесть и оценить результаты ИФА.

владеть:

- навыками интерпретации результатов иммунологических методов диагностики инфекционных заболеваний;

- навыками по учету, оценке и интерпретации результатовреакций иммунитета: РСК, РИФ, ИФА.

5. План изучения темы:

5. 1. Контроль исходного уровня знаний:

- собеседование по контрольным вопросам:

1. Механизм РСК.

2. Системы, участвующие в РСК.

3. Практическое использование РСК.

4. Цели использования РИФ (прямая и непрямая), ИФА.

5. Критерии учета результатов РИФ, ИФА.

6. Критерии достоверности результатов РИФ, ИФА.

7. Достоинства РИФ, ИФА.

8. Практическое использование РИФ, ИФА.

Тесты:

1. РСК ОСНОВАНА НА АКТИВАЦИИ

1) антигенов

2) антител

3) эритроцитов

4) гемолизина

5) комплемента

2. СВОЙСТВО КОМПЛЕМЕНТ, ИСПОЛЬЗУЕМОЕ В РСК

1) ферментативная активность

2) способность к самоорганизации и лизису клеток

3) термолабильность

4) антимикробная активность

5) фагоцитарная активность

3. ЦЕЛЬ РСК ПРИ ИЗУЧЕНИИ КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ

1) оценка иммунного статуса

2) серодиагностика врожденного иммунодефицита

3) сероидентификация микроорганизмов

4) серодиагностика инфекционных заболеваний

5) определение группы крови

4. ПАРНЫЕ СЫВОРОТКИ:

1) сыворотки однояйцовых близнецов

2) сыворотки разнояйцовых близнецов

3) сыворотки, взятые из разных вен

4) сыворотки двух обследуемых при диагностике одного заболевания

5) сыворотки одного обследуемого, взятые в динамике заболевания

5. ФЕРМЕНТ ЯВЛЯЕТСЯ МЕТКОЙ В СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ РЕАКЦИИ

1) РА

2) РП

3) РСК

4) ИФА

5) РИФ

Основные понятия и положения темы.

Преимуществом ИФА перед классическими серологическими реакциями (РА, РНГА, РСК) является возможность определения количества антител (или антиген1. без использования серийных разведений. Интенсивность окраски в лунке пропорциональна количеству фермента, следовательно, количеству искомых антител (или антиген1.. Измеряя с помощью спектрофотометра оптическую плотность содержимого лунки и сравнивая ее с контролем, определяют количество искомого компонента.

Достоинством ИФА при серодиагностике инфекционных заболеваний является также возможность определения классов специфических антител (Ig M, Ig G, Ig A), что имеет значение для определения периода инфекционного процесса, выявления носительства возбудителя и контроля проводимой терапии.

При этом использование для постановки ИФА моноклональных антител позволяет достичь высокой специфичности, что в сочетании с высокой чувствительностью делает ИФА одним из наиболее распространенных методом в прикладной иммунологии.

В РИФ происходит взаимодействие антигенов и антител, меченных красителями, флюоресцирующими при облучении их коротковолновым светом (ультрафиолетовым, фиолетовым, синим), например, изотиоционат флюоресцина, дающий зеленовато-желтое окрашивание. С помощью РИФ можно быстро обнаруживать даже ничтожные количества антигенов, в том числе бактериальных и вирусных, по эффекту флюоресценции комплекса «антиген + антитело» в люминесцентном микроскопе. Лучше использовать моноклональные антитела, каждое из которых нацелено против единственного антигенного эпитопа и поэтому в отличие от поликлональных антител не будет давать нежелательных перекрестных реакций с другими микроорганизмами.

5.3. Самостоятельная работа по теме:

Учтите и оцените результаты РСК с гонококковым антигеном и сыворотками обследуемых.

РСК является сложной двухэтапной серологической реакцией, в которой участвуют две системы антиген + антитело и комплемент. Первая система – основная, содержит антиген, антитело и комплемент. В случае образования комплекса антиген + антитело происходит активация и связывание комплемента, но визуально этого не видно. В качестве индикаторной системы используется вторая система, содержащая в качестве антигена эритроциты барана, а антитела – гемолитическую сыворотку с антителами к эритроцитам барана, т. е. готовый иммунный комплекс. Если антиген и антитело в первой системе соответствуют друг к другу, то образующийся комплекс активирует и связывает комплемент, поэтому при добавлении индикаторной системы гемолиза не происходит (РСК положительная). Если в первой системе антиген не соответствует антителу, то комплекс не образуется и комплемент остается свободным, активируясь и связываясь второй системой, вызывая при этом гемолиз эритроцитов (РСК отрицательная).

РСК требует особой подготовки. Все ингредиенты берут в определенном объеме (0,5 мл при бактериальных инфекциях, 0,1 мл – при вирусных инфекциях) и в определенном количестве, которое определяют путем титрования. Заполните дома таблицу 1.

Таблица 1.

Ингредиенты РСК	Характеристика ингредиентов
способ получения	рабочая доза
Антиген
Сыворотка обследуемого (при серодиагностике)
Иммунная сыворотка (при сероидентификации)
Комплемент
Гемолизин
Эритроциты барана