Схема постановки основного опыта РСК

Леч., пед. ф-ты 2006

ЗАНЯТИЕ 11

Тема: Реакция связывания комплемента. Реакции с участием меченных антител: иммуноферментный анализ, реакция иммунофлюоресценции.

Цель: Изучить серологические реакции: реакцию связывания комплемента (РСК), реакцию иммунофлюоресценции (РИФ), иммуноферментный анализ (ИФА).

Знать:

1. Реакцию связывания комплемента, особенности постановки, практическое использование.

2. Сущность РИФ, разновидности, методику постановки, практическое использование.

3. Сущность ИФА, методику постановки, практическое использование.

Уметь:

1. Учесть и оценить результаты РСК.

2. Учесть и оценить результаты РИФ.

3. Учесть и оценить результаты ИФА.

Контрольные вопросы:

1. Механизм РСК.

2. Системы, участвующие в РСК.

3. Практическое использование РСК.

4. Цели использования РИФ (прямая и непрямая), ИФА.

5. Критерии учета результатов РИФ, ИФА.

6. Критерии достоверности результатов РИФ, ИФА.

7. Достоинства РИФ, ИФА.

8. Практическое использование РИФ, ИФА.

Задания, выполняемые в ходе занятия (УИРС):

1. Учесть и оценить результаты РСК (реакции Вассермана) с антигеном для реакции Вассермана и сыворотками обследуемых на сифилис.

2. Учесть и оценить результаты РИФ (прямая) с исследуемым материалом (отделяемое карбункула) и люминесцирующей сибиреязвенной сывороткой.

3. Учесть и оценить результаты ИФА с сыворотками доноров на ВИЧ-инфекцию.

4. Биопрепараты: антиген для реакции Вассермана, диагностические сыворотки для РСК, диагностикумы для РСК; люминесцирующая сибиреязвенная сыворотка (ФИТЦ), тест-система иммуноферментная для определения антител к ВИЧ.

Методические указания к выполнению исследовательского задания:

1. Учтите и оцените результаты РСК (реакции Вассермана) с антигеном для реакции Вассермана и сыворотками обследуемых на сифилис.

РСК является сложной двухэтапной серологической реакцией, в которой участвуют две системы антиген + антитело и комплемент. Первая система – основная, содержит антиген, антитело и комплемент. В случае образования комплекса антиген + антитело происходит активация и связывание комплемента, но визуально этого не видно. В качестве индикаторной системы используется вторая система, содержащая в качестве антигена эритроциты барана, а антитела – гемолитическую сыворотку, содержащую антитела к эритроцитам барана, т. е. готовый иммунный комплекс. Если антиген и антитело в первой системе соответствуют друг к другу, то образующийся комплекс активирует и связывает комплемент, поэтому при добавлении индикаторной системы гемолиза не происходит (РСК положительная). Если в первой системе антиген не соответствует антителу, то комплекс не образуется и комплемент остается свободным, активируясь и связываясь второй системой, вызывая при этом гемолиз эритроцитов (РСК отрицательная).

РСК требует особой подготовки. Все ингредиенты берут в определенном объеме (0,5 мл при бактериальных инфекциях, 0,1 мл – при вирусных инфекциях) и в определенном количестве, которое определяют путем титрования. Заполните дома таблицу 1.

Таблица 1.

Ингредиенты РСК	Характеристика ингредиентов
способ получения	рабочая доза
Антиген
Сыворотка обследуемого (при серодиагностике)
Иммунная сыворотка (при сероидентификации)
Комплемент
Гемолизин
Эритроциты барана

Схема постановки основного опыта РСК

№ системы	Ингредиенты, мл	Опыт	Контроли
сыворотки	антигена
1.	Исследуемая сыворотка в разведении 1:5 Антиген (рабочая доза) Комплемент (рабочая доза) Изотонический раствор хлорида натрия	0,5 0,5 0,5 - 37° С – 1 ч	0,5 - 0,5 0,5	- 0,5 0,5 0,5
2.	Гемолитическая система*	1,0 37° С – 1 ч	1,0	1,0

Примечание: * - гемолитическую систему готовят, смешивая в равных количествах гемолитическую сыворотку в тройном титре и 3% взвесь эритроцитов барана; выдерживая смесь в течение часа при 37° С.

Результаты РСК предварительно учитывают после извлечения пробирок из термостата и окончательно – спустя 15-18 ч после пребывания их при комнатной температуре или в холодильнике.

Интенсивность реакции выражают плюсами:

++++ - реакция резко положительная, характеризующаяся полной задержкой гемолиза (эритроциты оседают на дно, жидкость бесцветная);

+++ - реакция положительная, характеризующаяся частичным гемолизом (лизировано ~ 25% эритроцитов, осадок меньше, жидкость розовая);

++ - реакция положительная, характеризующаяся гемолизом (лизировано ~50% эритроцитов, осадок небольшой, жидкость розовая);

+ - реакция сомнительная (лизировано ~75% эритроцитов, незначительный осадок, жидкость интенсивно окрашена);

_ - реакция отрицательная (лизированы все эритроциты, жидкость интенсивно окрашена и прозрачна -лаковая кровь).

Достоверность результатов подтверждается контролями ингредиентов. Заполните дома таблицу 2.

Таблица 2.

№ пп	Контроли	Контролируемое свойство
1.	КС = С + К + Г + Э + физ. раствор
	КА = А + К + Г + Э + физ. раствор
3.	КГС = К + Г + Э + физ. раствор
4.	КГ = Г + Э + физ. раствор
5.	КЭ = К + Э + физ. раствор
6.	КК = К + Э + физ. раствор

Обозначения: С – сыворотка; А – антиген;

К – комплемент; Г – гемолитическая сыворотка;

Э – эритроциты; ГС – гемолитическая система.

Оценка результатов: положительная реакция с интенсивностью не меньше ++ при достоверных контролях свидетельствует о наличии антител и серологическом подтверждении клинического диагноза; отрицательная реакция при достоверных контролях свидетельствует о том, что антитела не выявлены и серологически клинический диагноз не подтвержден.

РСК используется, помимо диагностики сифилиса, при хронической гонорее, риккетсиозах, вирусных инфекциях.

2. Учтите и оцените результаты РИФ (прямой) с исследуемым материалом (отделяемое карбункула) и люминесцирующей сибиреязвенной сывороткой.

Постановка: готовится фиксированный препарат-мазок из исследуемого материала, на который наносится люминесцирующая сибиреязвенная сыворотка, содержащая антитела к бациллам сибирской язвы, меченные флюоресцентным красителем (ФИТЦ – флюоресцеина изотиоцианат). Препарат помещают во влажную камеру, инкубируют 30 мин при 37°С, после чего его промывают водой и высушивают. Учет результатов реакции осуществляется с помощью люминесцентного микроскопа, позволяющего освещать препарат ультрафиолетом, что заставляет флюорохром светиться.

Критерии учета и оценки: при положительной РИФ – в результате соединения специфических антител, меченых флюорохромом, с антигенами микробных клеток в препарате выявляют светящиеся микроорганизмы, сходные по морфологии, размерам и взаимному расположению с предполагаемым возбудителем.

Бациллы сибирской язвы – это крупные палочки длиной до 7-8 мкм, с отрубленными концами, располагающиеся в патологическом материале короткими цепочками, парами или одиночно.

3. Учтите и оцените результаты ИФА с сыворотками доноров на ВИЧ-инфекцию.

Постановка: для определения специфических антител используют специальные панели из полистирола, в лунках которых фиксирован инактивированный вирус или его антигены. В лунки вносят сыворотки обследуемых и инкубируют. При этом гомологичные антигену антитела прикрепляются к нему. Не прикрепившиеся антитела удаляют промыванием буферным раствором. Затем в лунки вносят антитела против иммуноглобулинов (антител) человека, меченные пероксидазой. Если в исследуемой сыворотке присутствовали искомые антитела, то на данном этапе они, выступая в качестве антигена, прореагируют с меченными античеловеческими антителами. Добавление после отмывки субстрата (ортофенилендиамина – ОФД) позволяет учесть результаты реакции. Образование продукта, окрашенного в желто-коричневый цвет, оценивается как положительная реакция.

Критерием достоверности являются контроли: с сывороткой, заведомо содержащей антиВИЧ - ИФА «+» и сывороткой, заведомо не содержащей антиВИЧ — ИФА «-».

Для проведения ИФА широко используют 96-луночные полистироловые планшеты, т. к. на полистироле легко адсорбируются антитела, а после специальной обработки – различные антигены. Для работы с этими планшетами используются многоканальные автоматические пипетки, позволяющие вносить ингредиенты одновременно в несколько лунок панели, а также автоматические и полуавтоматические устройства для промывания лунок. Существуют и специальные автоматы, позволяющие осуществлять все эти этапы ИФА практически без участия человека. Преимуществом ИФА перед классическими серологическими реакциями (РА, РНГА, РСК) является возможность определения количества антител (или антигена) без использования серийных разведений. Интенсивность окраски в лунке пропорциональна количеству фермента, следовательно, количеству искомых антител (или антигена). Измеряя с помощью спектрофотометра оптическую плотность содержимого лунки и сравнивая ее с контролем, определяют количество искомого компонента.

Достоинством ИФА при серодиагностике инфекционных заболеваний является также возможность определения классов специфических антител (Ig M, Ig G, Ig A), что имеет значение для определения периода инфекционного процесса, выявления носительства возбудителя и контроля проводимой терапии.

При этом использование для постановки ИФА моноклональных антител позволяет достичь высокой специфичности, что в сочетании с высокой чувствительностью делает ИФА одним из наиболее распространенных методом в прикладной иммунологии.

4. Ознакомьтесь и опишите в таблице предложенные биопрепараты, указав, что они содержат, для чего и как применяются.

Вопросы для самоконтроля:

1. Цель прогревания (56° 30 мин.) сывороток, используемых в РСК.

2. Методика постановки ИФА с целью определения специфических антител.

3. Методика постановки ИФА с целью определения специфического антигена.

4. Методика постановки РИФ с целью экспресс-диагностики заболеваний.

5. Назовите отличие непрямой РИФ от прямой и ее преимущества при определении специфических антигенов.

Литература:

Учебники:

1. Борисов Л. Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. – М.: ООО «МИА», 2002. – С. 335-339.

2. Поздеев О. К. Медицинская микробиология / Под ред. акад. РАМН В. И. Покровского. - М.: ГЭОТАР Медицина, 2001. – С. 192-195, 247-250.

Лекции по микробиологии.