Фракціонування на іоннообмінниках
Для хроматографічного аналізу міоглобінів використовують ДЕАЕ-целюльозу або ДЕАЕ-сефадекс. Перед фракціонуванням кристалічний препарат міоглобіну переводять в метформу, додаючи до розчиненного в мінімальній кількості бідистилята міоглобіну ферріціанід калію.
Обладнання і матеріали: колонка з G-25 (діаметром ~2см висотою 50см), іоннообмінник, спектрофотометр, метміоглобін, ДЕАЕ-целюльоза.
Реактиви: 1. Тріс- НCl буфер, рН 8.3. – Готують вихідний 1м розчин трісу на бідистиляті (12,12 г трісу в 100 мл води) додаючи по краплях конц. НCl доводять рН до 8.3. Шляхом розведення готують буферні суміші з молярністю 0.005, 0.01, 0.05, 0.1 М розчини.
2. 0,1 н НCl.
3. 0.1 н NaOH.
5. Фосфатний буфер, рН 6.5:
Готують вихідні розчини 0.2 М KH2PO4 (М=139 - 6.804 г розчинити в 250 мл деіонізованої води), 0.2 М NaH2PO4 (М=141,96 - 7.098 г розчинити в 250 мл деіонізованої води);
26.2 мл 0.2 М NaH2PO4 титруємо 0,2 М розчином KH2PO4 до рН 6,5.
Для отримання 0.01 М буферу одержаний після титрування буфер розводять деіонізованою водою в 20 разів. Контролюють іонну силу буфера за допомогою кондуктометра.
Хід роботи:
Метміоглобін піддають гельфільтрації на колонці з G-25 для очистки від сульфату амонію. Обезсолений міоглобін фільтрують через G-25 з 0,005 М тріс-НCl буфером, рН 8,5-8,8. Проводять тест – аналіз на визначення рН білка зв’язаного з іоннообмінником. Іоннообмінник, що використовується, активується наступним чином: ДЕАЕ-целюльозу заливають невеликим об’ємом дистиляту, додаючи до смоли, що набухла, 0.1 н NaOH, перемішують на протязі 3-х хв., залишають для декантації маленьких частинок смоли. Потім зливають надосадову частину, яка неосіла на протязі 10 хв. До осаду смоли додають велику кількість води і відмивають NaOH, одночасно декантуючи смолу. За ступенем відмивання від лугу слідкують за допомогою індикаторного паперу. При досягненні нейтрального значення рН додають 0,1 н НCl і витримують смолу такий самий час, як і з NaOH (10 хв.). Відмивають НCl шляхом описаної вище процедури.
Після досягнення нейтрального значення рН до суспензії смоли додають тріс-НCl-буфер, вносять смолу в колонку для хроматографічного аналізу і стабілізують до вихідного стану смоли (рН 8.3, 0,005 М буфер). Попередньо стабілізований білок у вказанному буфері вноситься в колонку і хроматографується при швидкості виходу буфера з колонки, що дорівнює 40 мл в год. Заміну буферів, з зростаючою молярністю проводять по мірі виходу з колонки неадсорбованих компонентів. Вміст білка в пробах визначають спектрофотометрично, використовуючи коефіцієнт екстинції. Будують графік елюції.
Для одержання однорідного препарата міоглобіну, фракції, одержані в результаті хроматографії на ДЕАЕ-целюльозі піддають рехроматографії. Для цього проби однієї зливають в один стакан, розводять водою до іонної сили суміші 0.01 М, додаючи невелику кількість сухого кристалічного KH2PO4, доводять величину рН до 6,5. Рехроматографію проводять на КМ-целюльозі-32. При цьому значенні рН білок зв’язування всього рехроматографованого білка, проводять ступеневу елюцію, збільшуючи молярність фосфатного буферу.
ДИСК-ЕЛЕКТРОФОРЕЗ.
Дослідження гетерогенності взірців проводили методом диск-електофорезу в поліакриламідному гелі, описану Маурером. Цей метод являє собою об’єднаня методів розділення макромолекул по молекулярній масі і заряду та має високу розділяючу здатність.
З хімічною точки зору, поліакриламід який використовуються для електофорезу є сополімером двох мономерів: акриламіду і метиленбісакриламіду. Структура полімеру описується наступною формулою:
-СН2-СН(СОNН)СН2-СН(СО-СН2)-
 |
-СН2-СН(СОNН)СН2-СН(СО-СН2)-
Гідрофільні властивості цього гелю викликані наявністю амідних груп, які повторюються через рівні інтервали.
Процес полімеризації акриламіду і метиленбісакриламіду починається в присутності тетраметилметилендіаміна (ТЕМЕД) та каталізатора персульфат амонію ((NH4)2SO4).
Змінюючи концентрацію акриламіду і метиленбісакриламіду можна отримати гель з бажаючими розмірами пор.
При виборі концентрації акриламіду для отримання гелю враховують орієнтовану молекулярну масу фракціонованих речовин і форму їх молекул. Ми використовували гель 7.5%.
Обладнання: скляні трубочки, прилад для електрофорезу, джерело живлення.
Реактиви: Нами була вибрана наступна система для проведення диск-електрофореза:
1. Для приготування гелів:
Реактив А: 1 н НCl - 12 мл
ТРИС - 9.16 г
ТЕМЕД - 0.06 мл
Вода (б.дист.) - 25 мл
Реактив В: 1 н НCl - 12 мл
ТРИС - 1.495 г
ТЕМЕД - 0.115 мл
Вода (б/дист.) - 25 мл
Реактив С: метиленбісакриламід - 0.184 г
акриламід - 7 г
Вода (б. дист.) - 25 мл
Реактив D: метиленбісакриламід - 0.625 г
акриламід - 2.5 г
Вода (б. дист.) - 25 мл
Примітка: Акриламід та метиленбісакриламід розчиняти окремо (загальний об’єм зберігається).
Реактив Е: 0.004% рибофлавін (1 мг висушують на протязі доби під H2SO4 і розчиняють 25 мл бідистиляту).
Реактив F: 40% cахароза (40 г сахарози до 100 мл води б/д).
Персульфат амонію: 0.14% розчин (14 мг персульфату в 10 мл води б/д).
(Готують безпосередньо перед приготуванням гелю.)
2. Тріс-гліциновий буфер 0.05 М рН 8.3:
Тріс – 6 г + Гліцин – 28,8 г. + Вода бідист. – до 1 л.
Пред заповненням електрофоретичних камер буфер розвести в 10 разів.
3. Фіксуються: 5%-ним розчином ТХО або 7%-ним розчиним оцтової кислоти.
4. Фарбуються: 0,1% розчином Кумассі G-250 або амідочорним B-10.
Хід роботи:
Одержання дрібнопористого гелю:
Дрібнопористий гель готували в співвідношенні:
А:С: персульфат :Н2О = 1:2:4:1
Приготовану суміш добре перемішували і заливали в скляні трубочки, які попередньо були запарафіновані з одного кінця. Висота стовбчика, утвореного сумішю в гелі, повинна складати 5-7 см. При внесенні в трубочку слідкувати, щоб не утворювались пухирці. Для створення рівної поверхні гелю зверху на суміш вносять за допомогою шприца декілька крапель бідистиляту. Нашаровувати обережно, щоб не відбувалося змішування із сумішю майбутнього гелю. Полімеризувати в термостаті при температурі 37°С.
Одержання крупнопористого гелю:
Крупнопористий гель готували в співвідношенні: 1
B:D:E:F = 1:2:1:4
В кожну трубочку на отриманий дрібнопористий гель нанести крупнопористий висотою по 0.2-0.4 мл приготованої суміші. Зверху так само нашаровують воду. Полімеризували дрібнопористий гель за допомогою ультрафіолету (на протязі @ 20 хвилин – доки не стане молочно-білим). Забрати фільтрувальним папером воду, перед нанесенням зразка.
Нанесення зразка: Концентрація зразка, що вводиться в трубочку, складає 100-150мкг. Для швидкого визначення концентрації білка можна використовувати спектрофотометричний метод, знаючи коефіцієнт екстинції. Зразок, що вноситься, змішують з 40% розчином сахарози. Об’єм зразка з сахарозою не повинен перевищувати об’єму концентруючого геля.
Електрофорез: Трубки виймають із штативу. знімають парафінове дно, поміщають в електродну камеру. При введені трубок у буфер нижньої електродної камери необхідно слідкувати за тим, щоб на кінцях трубок не було пухирців повітря.
Електрофорез проводити в тріс- гліциновому буфері рН 8,3 на протязі 20 хвилин при силі струму 2 мА на трубочку , а потім при силі струму на одну трубочку складає 4 мА. В якості індикатора використовують бромфеноловий синій, який додають по краплі у верхній буфер (в трубочки). Підключаються електоди так, щоб “плюс” знаходився у нижній камері, а “мінус” – у верхній. В загальному електофорез протікає 1,5-2 години, доки мітка не почне виходити з трубочок.
Фіксування:По закінченню електрофореза гелі видаляються шприцем з тонкою голкою (з водою) і залежно від того чи будемо проводити визначення активності ферментів (1) чи білкових зон (2) занурююмо в розчини: в першому випадку – в рекційну суміш, а в другому - фіксуються 5%-ним розчином ТХО або 7%-ним розчиним оцтової кислоти на протязі 15-20 хвилин, потім відмиваються водою.
Фарбування: фарбуються на протязі 1 години 0,1% розчином Кумассі або амідочорного, надлишок фарби відмивають 7%-ним розчином оцтової кислоти.
Обробка результатів: Одержані результати деситометрують на денситометрі і проводять обробку електрофореграм чи проводили визначення коефіцієнту рухливості (Rf) для кожної з виявлених білкових зон за формулою:
Rf = S1/S, де
S1 – пробіг, який пройшла речовина, для якої визначається Rf,
S – загальний пробіг при електорофорезі (від старту до мітки)
3.2.2. Фракціонування білків
методом іонообмінної хроматографії
В основі розділення сполук методом іонообмінної хроматографії лежить реакція іонного обміну між аналізованою сполукою та сорбентами-іонітами, які містять іонізовані групи.
Сильні іоніти, функціональні групи яких утворені сильними кислотами або основами, можуть бути іонізовані повністю в усьому діапазоні робочих значень рН (3,0–11,0). Слабкі іоніти, функціональні групи яких утворені слабкими кислотами або основами, можуть бути іонізовані не повністю і лише в обмеженому інтервалі значень рН.
У разі фракціонування білків методом іонообмінної хроматографії важливе значення має вибір іонообмінника (природі матриці та ємності іоніту) і буферного розчину, за якого відбувається сорбція білків (значення рН та іонної сили, природа буфера та буферної ємності).
Під час роботи з білками як сорбенти використовують іоніти, які мають високий ступінь гідрофільності.
Білки можуть бути розділені як на катіонітах, так і на аніонітах. Вибір іоніту залежить від ізоелектричної точки матеріалу для хроматографії та стійкості білка в певному діапазоні значень рН.
Ефективна сорбція білків відбувається за значень рН, які відстають не менше ніж на одиницю від рІ. В інтервалі рН < рІ – 1 білки фракціонують методом хроматографії на катіонітах, а в діапазоні рН > рІ + 1 – на аніонітах. Зміна рН у напрямі до ізоелектричної точки сприяє десорбції білків. Під час роботи з білками використовують буферні розчини з низькою іонною силою, проте високою буферною ємністю. Для цього користуються буферними розчинами, рК яких відстає від значення рН, яку застосовують в експерименті, не більше ніж на 0,3–0,5 одиниці рН. Хроматографію на аніонітах проводять у таких системах, де дисоційованим компонентом є катіон (буфери: трис, піридин, імідазол та ін.), а для катіонітів дисоційованим компонентом аніон (ацетатний, фосфатний, бікарбонатний буфери та ін.).
У разі іонообмінної хроматографії суміш білків сорбується у верхній частині колонки і тоді зазнає витискання речовинами, які зменшують їхню сорбцію на іоніті. Зниження сорбції відбувається у випадку підвищенної іонної сили розчину і (або) зміни його рН. Зміну рН та іонної сили елюювального буферного розчину можна проводити шляхом створення ступінчастої або градієнтної елюції. У разі створення ступінчастого градієнта використовують серію буферних розчинів, які пропускають через колонку послідовно один за одним. За такого типу елюювання кожен з елюювальних буферних розчинів пропускають через колонку доти, поки концентрація білка в елюаті, який витікає з колонки, пройшовши через максимум, не знизиться майже до вихідних фонових значень. Під час неперервного градієнту елюції зміна іонної сили та (або) рН елюювального розчину відбувається поступово, лінійно або нелінійно залежно від об’єму рідини, яка протікає через колонку. Лінійну зміна іонної сили або рН елюювального розчину використовують тоді, коли ці параметри змінюються пропорційно до об’єму рідини, яка протікає через колонку. Отримати лінійний градієнт можна за допомогою спеціального приладу (див. рис. 3.33, а).
Підготовка іонообмінників до роботи. Використанню іонітів в іонообмінній хроматографії для розділення білків передує їхня попередня обробка. Іоніти промислового виготовлення після набухання фракціонують за розміром частинок (однорідність частинок сорбенту за розміром є однією із найважливіших умов успішної хроматографії) і піддають „циклізації” переходу з однієї форми в іншу. Катіоніти переводять з Na+-форми в Н+-форму або навпаки, а аніоніти – з Cl–-форми в НО–-форму або навпаки. У процесі такої обробки стабілізується структура іоніту і функціональні групи стають більш доступними. Водночас іоніт вивільняється від домішок.
Наважку порошку сорбенту ресуспендують в 50-кратному і більшому об’ємі дистильованої води, перемішують і залишають набухати на ніч. Шар рідини над іонообмінником декантують, знову заливають дистильованою водою, перемішують і через 2,0–2,5 год верхній шар рідини декантують разом із дрібними частинками, які не осіли. До осаду, що залишився, доливають 50-кратний об’єм 0,5 н. NaОН, ретельно перемішують і через годину іоніт фільтрують через лійку Бюхнера (на всіх стадіях обробки іоніту фільтрування можна замінити декантацією або центрифугуванням). Осад на лійці промивають водою до досягнення рН 7,0. Згодом іоніт перемішують у 50-кратному об’ємі 0,5 н. НCl і через 30–60 хв (тривалість обробки іоніту кислотою не повиненна перевищувати зазначеного часу) відмивають дистильованою водою приблизно до рН 5,0. На наступному етапі у випадку з аніонітами, наприклад, ДЕАЕ-целюлозою, сорбент повторною обробкою лугом переводять у НО–-форму. Для цього його суспендують у 50-кратному об’ємі 0,5 н NaОН, перемішують і через 1 год відмивають дистильованою водою до рН води. У випадку з катіонітом, наприклад, КМ-целюлозою, сорбент повторною обробкою кислотою переводять у Н+-форму. Для цього його суспендують у 50-кратному надлишку 0,5 М розчину НCl протягом 30–60 хв. Після фільтрування сорбент відмивають дистильованою водою дотих, доки рН промивної рідини не досягне рН води.
Щоб вилучити з іонів дрібні й великй частки його суспендують у циліндрі об’ємом 1 л, перемішують, відстоюють 20–30 хв і верхній шар рідини з неосілими дрібними частинками декантують. Таку процедуру повторюють п’ять–шість разів, доки рідина над осадом не буде чистою. Щоб позбутися великих частинок, іоніт суспендують у воді, перемішують і через ~1 хв суспензію зливають в інший циліндр.
Після описаної роботи іоніт урівноважують буферним розчином, у якому проводять сорбцію білків на іонообміннику (вихідний буферний розчин). Цю процедуру можна проводити як на колонці, так і без неї. Обробку вихідним буферним розчином проводять доти, поки не врівноважиться рН елюату на виході з колонки (або рідини, у якій суспендують іоніт) з рН вихідного буферного розчину. Урівноваження – процес дуже повільний. Для його пришвидшення іоніт можна спочатку обробити розчином такого самого складу, що й вихідний, але з більшою концентрацією, а після досягнення потрібного значення рН урівноваження продовжують вихідним розчином. Інший спосіб урівноваження полягає в тому, що іоніт суспендують у вихідному буферному розчині до отримання достатньо рідкої суспензії. Додаванням розчину, який містить, відповідно, кислий або основний компонент вихідного буфера, доводять рН (на рН-метрі) до потрібного значення. Згодом сорбент урівноважують вихідним буферним розчином. У всіх випадках кінцевий стан рівноваги (значення рН) необхідно контролювати.
Регенерація. Іонообмінники можна багаторазово використовувати. Тому після завершення роботи їх потрібно регенерувати. Для цього до використаного сорбенту додають 30-кратний об’єм 0,2–0,5 н. розчину NaОН, перемішують до утворення однорідної суспензії і фільтрують на лійці Бюхнера. Обробку лугом проводять двічі. Після цього іоніт відмивають дистильованою водою до нейтральної реакції фільтрату. Регенерований іонообмінник урівноважують відповідним буферним розчином.
Зберігання. Іонообмінники на основі целюлози і декстрану можна зберігати у вологому стані недовго. Аніоніти ліпше зберігати у сольовій формі та в Н+-формі. У разі зберігання набухлих іонообмінників до них додають антисептики (суспензію сефадексу зберігають у холодильнику з антисептиками: 0,02% азиду натрію, мертіолату або хлороформу; у разі додавання толуолу (кілька крапель на 1 л) треба пам’ятати, що толуол поглинає світло при 280 нм, а розчинність його в деяких буферах, наприклад, трис-буфері, дуже висока).
Підготовка і заповнення колонки. Колонку заповнюють суспензією іоніту в елюювальному буферному розчині (див. 3.2.1). Заповнення колонки можна проводити суспензією іоніту у воді й лише після ущільнення шару сорбенту урівноважувати колонку елюювальним буферним розчином. Над верхнім шаром сорбенту завжди має збути шар рідини не менше 2 см.
Підготовка досліджуваного матеріалу. Розчин білка, який наносять на колонку, повинен мати ті самі значення рН та іонної сили, що й вихідний буферний розчин, яким урівноважений іонообмінник. Зразок переводять у вихідний буферний розчин, піддаючи його попередньому діалізу або гель-хроматографії. Якщо об’єм проби, яку піддаватимуть іонообмінній хроматографії, невеликий, то зразок можна розвести вихідним буферним розчином. Нерозчинні компоненти видаляють центрифугуванням або фільтрацією. Якщо досліджуваний білок зв’язується з іонообмінником міцно, то об’єм внесеного білкового розчину не має значення, а якщо він зв’язується досить слабко, то об’єм внесеного білкового розчину повинен бути незначним.
Елюція білків з колонки.Швидкість протікання елюату по колонці в разі іонообмінної хроматографії впливає на результат розділення. У випадку повільного протікання рідини, наприклад, у межах 8 мл/см2´год, розділення
є ліпшим, ніж у випадку протікання рідини через ту ж саму колонку зі швидкістю 20 мл/см2´год. На роздільну здатність колонки впливає і крутість створеного градієнту елюції: чим крутіший градієнт, тим гостріші піки на кривій елюції, проте ліпшому розділенню сприяє більш пологий градієнт.