Взятие и доставка в лабораторию проб фекалий

Рукой в резиновой перчатке берут примерно 100 г фека­лий из прямой кишки животных или только что выделивших­ся при испражнении. В последнем случае берут пробу с верх­ней части экскрементов, не соприкасавшейся с полом или поч­вой. Руку и пинцет после взятия каждой пробы тщательно моют. Пробы от мелких животных берут с помощью груши. Вращательными движениями наконечник груши вводят в пря­мую кишку. При сдавливании груши воздух входит в кишку. Затем наконечник груши вынимают. Эта манипуляция вы­зывает рефлекторный акт дефекации. После каждого взятия пробы наконечник груши тщательно промывают. Взятый материал регистрируют в описи сопроводительного доку­мента.

Каждую пробу помещают в пакетик из плотной бумаги или целлофановый, нумеруют и отправляют в лабораторию с описью в сопроводительном документе. В нем указывают хозяйство, отделение или владельца животных, вид и количество их в стаде (отаре, табуне), дату взятия проб и цель исследо­вания.

В лабораторию отправляют пробы не более суточной дав­ности со времени их взятия. При исследовании на диктиокаулез и стронгилоидоз пробы следует доставлять в лабораторию не позже чем через 4 ч после взятия.

Если нет возможности своевременно доставить пробы в лабораторию, их можно консервировать, используя для этой цели физические и химические методы консервации.

Из физических методов наиболее распространенным и простым является воздействие низких температур. Пробы по­мещают в холодильник при температуре +2…-4°С, что задерживает развитие личинок.

Можно использовать и различные химические средства:

ü жидкость Барбагалло (3%-ный раствор формалина в изо­тоническом растворе натрия хлорида). В ней пробы фекалий могут сохраняться до двух недель;

ü смесь, состоящую из формалина (5 мл), глицерина (5 мл) и воды (100 мл);

ü смесь, состоящую из 0,2%-ного натрия азотнокислого (1900 мл), раствора Люголя (250 мл), формалина (300 мл) и глицерина (25 мл).

Гельминтоскопия

Для обнаружения гельминтов в фекалиях их смешивают с водой (1:10) и смеси дают отстояться. Через некоторое вре­мя (не менее 5 мин) верхний слой воды сливают, а к осадку приливают новую порцию воды. Так повторяют несколько раз, что позволяет удалить большую часть посторонних веществ, а в осадке остаются паразиты и нерастворимые тяжелые час­ти фекалий. Затем осадок исследуют макро- и микроскопи­чески.

Макроскопическое исследование. Промытый осадок фе­калий вновь разбавляют водой, небольшими порциями нали­вают в черную кювету и при медленном покачивании ее вни­мательно просматривают осадок. Можно брать осадок неболь­шими порциями, выливать в чашки Петри и просматривать под лупой или микроскопом. Некоторых гельминтов лучше просматривать на белом фоне. Поэтому рекомендуют одну половину кюветы окрашивать в черный цвет, другую – в бе­лый. Так последовательно просматривают весь материал. Обнаруженных паразитов выбирают препаровальной иглой или кисточкой и фиксируют.

Микроскопическое исследование. Для обнаружения мел­ких форм паразитов отмытый осадок исследуют в бактерио­логических чашках с помощью штативной лупы (6-10-крат­ное увеличение).

Гельминтоовоскопия

Оборудование и средства. Для проведения гельминтоовоскопии необходимо следующее оборудование и материалы: микроскоп биологический (МБИ) или микроскоп биологичес­кий стереоскопический (МБС), предметные и покровные стек­ла, бактериологические чашки, пинцеты, ножницы, стеклянные палочки, фарфоровые ступки и пестики, стаканчики из стекла или синтетического материала с верхним диаметром 4-5 см (мензурки в форме усеченного конуса на 50 мл), можно ис­пользовать баночки Флоринского, ситечки с металлической или покровной сеткой (кусочки чулочной ткани или марли) с ве­личиной сторон ячеек 0,25-0,3 мм, центрифужные пробирки, центрифуга до 2 тыс. об/мин, металлические петли с диамет­ром кольца 5-8 мм, спиртовая или газовая горелка, флотаци­онные растворы, десенсиметр для проверки плотности флота­ционных растворов, глицерин, молочная кислота, глазные пипетки, целлофановая пленка.

Приготовление флотационных растворов. Насыщенный раствор натрия хлорида (NaCl). В эмалированное ведро с кипящей водой порциями кладут соль, постоянно помешивая деревянной лопаточкой до полного ра­створения. Соль добавляют до тех пор, пока она не начинает выпадать в осадок. Для приготовления раствора требуется 420 г соли на 1 л воды. В горячем виде раствор фильтруют через марлю. При остывании раствора кристаллы хлорида натрия выпадают в осадок, что свидетельствует о плотности насыщенного раствора, равной 1,18-1,20.

Раствор свинца нитрата (азотнокис­лого свинца) (Pb(NO₃)₂). Соль растворяют в горячей воде порциями при подогревании и постоянном помешивании до полного растворения. На 1 л воды требуется 650 г соли. Фильтровать раствор не обязательно. Плотность насыщенно­го раствора 1,5. Он обладает высокой флотационной способностью. Однако уже через 24 ч после приготовления плот­ность несколько падает за счет выпадения частиц соли в оса­док. Поэтому перед употреблением раствор подогревают с размешиванием осадка. Плотность уточняют десенсиметром.

Нитрат свинца – соль тяжелого металла, при работе с ним следует соблюдать осторожность.

Раствор аммония нитрата (NH₄NО₃) готовят так же, как и предыдущий раствор. На 1 л воды расходуют 1500 г гранулированного порошка аммониевой селитры. Плот­ность раствора нитрата аммония должна быть 1,5.

Раствор натрия нитрата (NaNO₃) готовят путем добавления на 1 л воды 1 кг азотнокислого натрия. Плотность раствора равна 1,38-1,40.

Раствор цинка сульфата (ZnSO₄∙7H₂O) приготавливают при добавлении на 1 л воды 400 г сернокис­лого цинка. Его плотность равна 1,24.

Раствор натрия тиосульфата (Nа₂S₂О₃∙5Н₂О) с плотностью 1,4 готовят путем добавления к 1л воды 1750 г вещества.

Раствор магния сульфата (MgSO₄) с плотностью 1,26-1,28 готовят путем добавления 920 г соли yа 1 л воды.

Методы седиментации

Метод последовательных промываний применяют для ди­агностики трематодозов. Пробу фекалий (3-5 г) кладут в стаканчик или фарфоровую ступку, заливают небольшим ко­личеством воды и, размешивая стеклянной палочкой (в ступке пестиком), добавляют воду до 50-100 мл. Смесь фильтруют через ситечко или марлю (1 слой) и отстаивают 3-5 мин. Затем верхний слой сливают, а к осадку добавляют такое же количество воды и процедуру повторяют до тех пор, пока надосадочный слой не будет прозрачным. Верхний слой слива­ют, а осадок порциями разливают в чашки Петри или на пред­метное стекло и микроскопируют.

Модификация метода по Т.Г. Никулину. Учитывая, что при последовательном сливании надосадочной жидкости про­исходит взмучивание, осадок и часть яиц трематод могут быть слиты. Т.Г. Никулин предложил отсасывать надосадочную жидкость грушей. При массовых исследованиях на наконеч­ник груши надевают кружок из картона (ограничитель). По­скольку во всех пробах в стаканчиках остается одинаковое количество осадка и он не взмучивается, результаты исследо­ваний являются более достоверными.

Метод седиментации с целлофановыми пленками по Г.А. Котельникову и В.М. Хренову предложен для диагно­стики фасциолеза и дикроцелиоза жвачных, аскариоза и трихоцефалеза свиней. Из гидрофильного целлофана толщиной 22 мкм нарезают прямоугольные кусочки 2x3 см и помещают их на 24 ч в бактериологическую чашку с 50%-ным раство­ром молочной кислоты или глицерина на одни сутки.

После приготовления целлофановых пленок берут пробу фекалий массой 2 г и размешивают в стаканчике с небольшим количеством воды. Взвесь фильтруют через металлическое ситечко или марлю (1 слой) в чистый стакан емкостью 50 мл, отстаивают 15 мин, сливают надосадочную жидкость, а к осад­ку добавляют 35-40 мл водопроводной воды, опять отстаива­ют 5 мин, надосадочную жидкость сливают, осадок переносят на предметное стекло и покрывают целлофановой пленкой. Через 8-10 мин проводят микроскопию препарата. Раствор молочной кислоты или глицерина просветляет препарат, а плен­ка предохраняет его от высыхания.

Флотационно-седиментационный метод Н.В. Демидо­ва применяют для диагностики фасциолеза. Пробу фекалий (от крупного рогатого скота – 5 г, от овец – 3 г) помещают в большой стакан, заливают доверху насыщенным раствором натрия хлорида и тщательно размешивают стеклянной палоч­кой до получения равномерной взвеси. Взвесь отстаивают 15-20 мин, затем чайной ложечкой или совочком удаляют всплывшие па поверхность грубые частицы. Жидкость отсасывают грушей (при массовом исследовании допускается сливание), оставляя 20-30 мл ее над осадком, к осадку доливают воду до полного объема стакана и тщательно размешивают палоч­кой. Взвесь фильтруют в большие стаканы, фильтрат отстаи­вают в течение 5 мин (для фильтрации используют марлю или металлическое ситечко с ячейками 0,25 мм), жидкость из стаканов отсасывают, оставляя на дне 15-20 мл осадка. Оса­док перемешивают в конических стаканчиках, большие стака­ны прополаскивают водой и выливают, смыв в маленькие, взвесь отстаивают в конических стаканчиках 3-5 мин, а жидкость отсасывают. Эту процедуру повторяют до просветления надосадочной жидкости, затем осадок переносят на предметное стек­ло и микроскопируют.

Методы флотации

Метод Фюллеборна. В стакане емкостью 200 мл разме­шивают 8-10 г свежих фекалий с 20-кратным объемом насы­щенного раствора натрия хлорида. После тщательного разме­шивания смесь фильтруют через металлическое или капроно­вое ситечко (можно через марлю) в другой чистый стакан емкостью 100 мл и оставляют на 45-60 мин. Затем проволоч­ной петлей с поверхности взвеси берут 3-6 капель и наносят на хорошо обезжиренное предметное стекло, покрывают по­кровным стеклом и микроскопируют.

Метод Дарлинга. Пробу свежих фекалий массой 5 г сме­шивают в стакане с водой в соотношении 1:10 и через ситечко или марлю процеживают в другой чистый стакан. Фильтрат отстаивают 5 мин, верхний слой жидкости сливают, не взмучи­вая осадка, а осадок с небольшим количеством оставшейся жидкости (10 мл) переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 2 мин при скорости 1500 об/мин. Надоса­дочную жидкость сливают, а к осадку приливают жидкость Дарлиига (глицерин, смешанный в равных частях с насыщен­ным раствором хлорида натрия). Пробирку встряхивают или размешивают палочкой, чтобы осадок смешался с флотацион­ной жидкостью, повторно центрифугируют в течение 2 мин при скорости 1500 об/мин. При наличии в пробе фекалий яиц гельминтов они всплывают на поверхность жидкости в центрифужной пробирке. Гельминтологической петлей берут 3-4 капли с поверхности взвеси, наносят на предметное стек­ло и микроскопируют.

Метод И.А. Щербовича выполняют по такой же методике, как и Дарлинга, но в качестве флотационной жидкости используют насыщенные растворы натрия гипосульфита или магния сульфата . Поскольку плотность указанных растворов выше, чем плотность жидкости Дарлинга, метод Щербовича используют для диагностики гельминтозов, яйца возбудителей которых имеют больший удельный вес (метастронгилез сви­ней, трихоцефалез, макраканторинхоз и др.).

Метод Г.А. Котельникова и В.М. Хренова наиболее эффективен при диагностике нематодозов, эймериозов и других паразитозов животных. Он выполняется в двух вари­антах.

Суть первого варианта состоит в том, что пробу фекалий массой 3 г кладут в стаканчик, добавляют раствор аммиачной селитры и тщательно размешивают стеклянной палочкой. За­тем порциями доливают раствор соли до 50 мл. Полученную взвесь фильтруют через металлическое или капроновое си­течко в другой стаканчик и дают отстояться в течение 10 мин. При диагностике стронгилятозов достаточно, чтобы взвесь от­стоялась в течение 3-5 мин. После этого гельминтологичес­кой петлей с поверхности взвеси снимают 3-6 капель с раз­ных мест, переносят их на предметное стекло и микроскопируют.

Второй вариант – метод флотации с аммиачной селитрой и с центрифугированием – это модификация метода Дарлинга при использовании в качестве флотационной жидкости на­сыщенного раствора аммиачной селитры. Он оказывается очень эффективным при диагностике ряда цестодозов, аскаридатозов, стронгилятозов и других паразитов.

Гельминтоларвоскопия

Оборудование и средства. Термостат, центрифуга, мик­роскоп биологический (МБИ) или микроскоп биологический стереоскопический (МБС), аппарат Бермана, чашки бактериологические, баночки Флоринского, часовые и предметные стекла, пипетки глазные, марля, вата, 0,1%-ный водный раствор метиленового синего, насыщенный раствор цинка сульфата, центрифужные пробирки, пинцеты, ножнички, топкая мягкая проволока, конические стаканчики, стеклянные палочки, ра­створ Люголя.

Метод Бермана. Пробы свежих фекалий (10 г) помещают завернутыми в марлю или на металлическую сетку в воронку аппарата Бермана. Предварительно резиновую труб­ку, присоединенную к воронке, закрывают зажимом и в ворон­ку заливают воду комнатной температуры (35-38°С). Фека­лии мелких жвачных оставляют в воронке на 4-6 ч, крупного рогатого скота и лошадей – на 10-12 ч. За это время личин­ки диктиокаулюсов выползают из пробы фекалий в воду и постепенно опускаются по трубке вниз к зажиму. По истече­нии указанного времени зажим открывают и жидкость из ниж­ней части трубки осторожно сливают в бактериологическую чашку и исследуют под микроскопом.

Метод Бермана-Орлова является модификацией метода Бермана. В аппарате Бермана на конец резиновой трубки за­жим не устанавливают, а плотно присоединяют пробирку. При помещении в воронку с теплой водой фекалий личинки гельминтов оседают на дно пробирки. По истечении необходимого срока (для мелкого рогатого скота – 4-6 ч, для крупного рогатого скота и лошадей – 10-12 ч) пробир­ку отсоединяют от резиновой трубки, жидкость аккуратно сли­вают или отсасывают пипеткой, а осадок помещают на пред­метное стекло или чашку Петри и микроскопируют.

Метод И.А. Щербовича. Пробу фе­калий (8-10 г) помещают на кусочек марли, концы которой закручивают тон­кой мягкой проволокой и подвешивают в стакан с водой температурой 35-38°С. Пробы фекалий мелких живот­ных и лошадей выдерживают в течение 3 ч, крупного рогатого скота – 12 ч. Затем пробу фекалий из стакана извлекают, воду осторожно (не взбол­тать) сливают, осадок помещают в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 1 мин со скоростью 1000 об/мин. Надосадочную жидкость в пробирке сливают, осадок перено­сят на предметное стекло и микроскопируют.

Метод Вайда. На предметное или часовое стекло кладут несколько шариков свежевыделенных фекалий овец или коз и добавляют небольшое количество воды температурой около 40°С. Если шарики помещают на предметное стекло, достаточно нескольких капель воды. Через 40 мин шарики удаля­ют, оставшуюся жидкость на стекле исследуют под микроско­пом па наличие личинок. Методика эффективна при условии, если фекалии плотные. Применяют для диагностики диктиокаулеза, мюллериоза, протостронгилеза, цистокаулеза овец и коз.

Флотация с раствором цинка сульфата – избиратель­ный экспресс-метод диагностики диктиокаулеза по Котельникову и Хренову. Пробы фекалий (по 5 г) овец и коз кладут в стаканчик с раствором цинка сульфата , в течение 1-2 мин энергично разгоняют по кругу, не растирая и не размешивая. Не менее чем через 5-10 мин пробы вынимают пинцетом, взвесь оставляют на 10-15 мин. Затем металлической пет­лей снимают 6 капель с поверхности жидкости, переносят на предметное стекло и микроскопируют.

Пробы от овец полужидкой консистенции и пробы от телят (5 г) также помещают в стаканчики с раствором цинка сульфата и выдерживают 20-30 мин без разгонки и размешива­ния. Затем фекалии удаляют, через несколько минут снимают металлической петлей 6 капель с поверхности пленки и мик­роскопируют. Личинки диктиокаулюсов в поверхностной плен­ке сохраняют подвижность до 3 ч. Метод обладает избира­тельностью в отношении личинок диктиокаулюсов. Личинки стронгилят пищеварительного тракта и стронгилоидов дефор­мируются и разрушаются в течение 1-2 мин, личинки мюллериусов свертываются спирально и напоминают пузырьки воз­духа.