Якісні реакції на основні групи біологічно активних речовин лікарської рослинної сировини
Для встановлення тотожності лікарської рослинної сировини використовують якісні реакції і хроматографічні методи аналізу на основні діючі та супутні речовини, які представлені в аналітичній нормативній документації на досліджуваний вид сировини, в розділі "Якісні реакції". Застосування якісного хімічного аналізу при встановленні та підтвердженні тотожності лікарських засобів рослинного походження набуває все більшого значення для підвищення якості аптечних лікарських форм.
Якісні реакції проводять безпосередньо на рослинній сировині, з водними витягами (рідше з додаванням лугів, кислот або з використанням органічних розчинників) із досліджуваної сировини. Для проведення якісних реакцій готують водний екстракт з подрібненої рослинної сировини у співвідношенні (1:10) шляхом кип'ятіння протягом 5-10 хвилин, після охолодження проціджують через вату.
Якісні реакції на основні групи природних сполук, що вміщуються
в лікарській рослинній сировині
| Об'єкт дослідження | Порядок проведення реакції | Результати реакції | |||
| 1. Вуглеводи. 1.1. Слиз | |||||
| Профільтрова-ний водний витяг (1:10), поперечний переріз або порошок сухої сировини. | 1. До 5 мл водного витягу (на поперечний переріз або порошок сухої сировини) додайте декілька крапель водного розчину гідроксиду амонію. 2. До 5мл настою додайте 95% етанол (1:1) | З'являється яскраво-жовте забарвлення. З’являється осад. | |||
| 1.2. Інулін | |||||
| Добре подріб-нений рослин-ний порошок або попереч-ний переріз сухої сировини. | 1. Порошок (0,05г.) або зріз сировини помістіть на предметне скло і додайте 1-2 краплі 15-20% спиртового розчину а - нафтолу, а потім 2-3 краплі концентрованої сульфатної кислоти і якщо необхідно, злегка підігрійте. 2. Порошок (0,05г) або зріз сировини помістіть на предметне скло і додайте 1-2 краплі спиртового розчину тимолу, а потім 2-3 краплі концентрованої сульфатної кислоти і якщо необхідно, злегка підігрійте. | З'являється фіолетове забарвлення. З'являється карміно-червоне забарвлення. | |||
| 1.3. Крохмаль | |||||
| Водна витяжка (1:10), поперечний переріз або порошок сухої рослинної сировини. | До 5 мл водного витягу (на поперечний переріз або порошок сухої сировини) додайте 2-3 краплі розчину Люголя. | З’являється синьо-фіолетове забарвлення | |||
| 2. Глікозиди. 2.1. Серцеві глікозиди | |||||
| Добре подрібнену рослинну сировину настоюють при струшуванні на 70%-ному етанолі (1:10) протягом 30 хв. Отриману витяжку проціджують через вату, після чого пропускають через колонку, яка заповнена 5г оксиду алюмінію. Колонку промивають 5 мл 70% -ного етанолу. Отриманий фільтрат досліджують на наявність глікозидів. | 1. У пробірку внесіть 1 мл фільтрату, додайте 1 мл розчину нітропрусиду натрію і перемішайте. В другу пробірку внесіть 2-3 мл 10%-ного розчину гідроксиду натрію і вміст першої пробірки обережно нашаровуйте на луг (реакція Легаля). 2. До 1-2 мл фільтрату додайте декілька крапель 1%-ного розчину пікринової кислоти, перемішайте. В другу пробірку внесіть 2-3 мл 10%-ного розчину гідроксиду натрію і вміст першої пробірки обережно нашаруйте на луг (реакція Бальє). 3. До 1-2 мл спиртового витягу додайте 0,5-1 мл ангідриду ацетату, після перемішування по стінках пробірки обережно нашаровуйте 1-2 мл концентрованої сульфатної кислоти (реакція Лібермана). 4. До 1-2 мл спиртової витяжки додайте 0,5 мл реактиву №1 (концентрована ацетатна кислота 99 мл і 1 мл 5%-ного розчину хлориду заліза (III)) і після змішування по стінках пробірки нашаруйте 1-2 мл реактиву №2 (99 мл концентрованої сульфатної кислоти і 1 мл 5%-ного розчину хлориду заліза (III)) (реакція Келлера-Кіліані). | На межі з'єд- нання рідин з'являється пос-тупово зникаюче буре або буро-червоне кільце (п'яти-членне лактонне кільце). На межі з'єднання рідин з'являється оранжево-червоне кільце (п'ятичленне лактонне кільце). На межі з'єд-нання шарів з'являється забарвлене кільце зелено-синіх відтінків (стероїдні спо-луки). На межі з'єднан-ня шарів з'явля-ється забарвлене кільце черво- нобурих відтінків (дезоксицукри) | |||
| 2.2. Сапоніни | |||||
| Водна витяжка з рослинної сировини (1:30), порошок сировини. | 1. 5 мл фільтрату енергійно струшуйте в пробірці. 2. Біля 0,2 г рослинного порошку помістіть в фарфорову чашку і додайте суміш з рівних кількостей концентрованої сульфатної кислоти і 95%-ного етанолу, підігрійте, після чого додайте краплю розчину хлориду заліза (ІІІ) | Утворюється стійка піна. З’являється послідовно жовте, червоне, фіолето- ве і синьо-зелене забарвлення. | |||
| 2.3. Антраглікозиди | |||||
| Водна витяжка (1:10), переріз або порошок сухої сирови-ни. | 1. До 5 мл профільтрованого витягу, на тон-кий зріз або порошок кори, коренів, корене-вищ додайте 1-2 краплі 10%-ного розчину гідроксиду натрію. 2. 1 г подрібнених листків прокип'ятіть протягом декількох хвилин з 10 мл розчину гідроксиду натрію, розведіть 10 мл води і профільтруйте. Після охолодження фільтрат підкисліть хлоридною кислотою до слабо-кислої реакції і перемішайте з подвійним об'ємом ефіру (хлороформу); після розділен-ня шарів, 5 мл ефірного (хлороформного) шару перенесіть в пробірку і додайте до нього 5 мл розчину гідроксиду амонію та перемішайте. | З'являється червоне забарвлення. Нижній шар з гідроксидом амо- нію (з ефірним екстрактом) або верхній шар у ви- падку одержання хлороформного екстракту забар- влюється у виш- нево-червоний колір (оксиметил-антрахінони) | |||
| 2.4. Фенологлікозиди | |||||
| Водний витяг з рослинної сировини (1:10) | 1. До 1 мл профільтрованої витяжки додайте кристалик сульфату заліза (ІІ). 2. До 1 мл фільтрату (у фарфоровій чашці) додайте 4 мл 10%-ного розчину гідроксиду амонію і нашаруйте по стінках 1 мл 10%-ного розчину фосфорномолібдату натрію в хлоридній кислоті | Бузкове забарвлення, яке переходить у фіолетове. З'являється синє забарвлення, яке переходить в зелене. | |||
| 2.5. Флавоноїдні глікозиди | |||||
| Витяг з рослинної сировини (1:10) на 70%-ному етанолі | 1. До 2 мл спиртового витягу додайте шматочок металічної смужки магнію або цинку і 3-5 крапель концентрованої хлоридної кислоти (ціанідинова реакція). При необхідності підігрійте. 2. До 2-3 мл витягу додайте 2-3 краплі розчину основного ацетату свинцю. 3. До 2-3 мл спиртового витягу додайте 2-3 краплі 3%-ного розчину хлориду заліза (III). | Протягом 1-2 хв утворюється роже-ве, темно-червоне або оранжеве забарвлення. З'являється жовте забарвлен- ня або осад (фе-нольні сполуки). З'являється коричневе або зе-лено-коричневе забарвлення (фе- нольні сполуки) | |||
| 3. Дубильні речовини | |||||
| Водна витяжка з подрібненої сировини (1:10) Водна витяжка з подрібненої сировини (1:10), поперечний переріз, порошок сировини. | 1. До 5 мл профільтрованої витяжки додайте декілька крапель 1%-ного розчину желатини і 1-2 краплі 10%-ного розчину хлориду натрію. 2. До 5 мл профільтрованої витяжки, на поперечний переріз або порошок сировини нанесіть 3-4 краплі 3% розчину хлориду заліза (III). 3. 5 мл водної витяжки підкисліть 2-3 краплями розведеної ацетатної кислоти і додайте 10 мл 10%-ного розчину ацетату свинцю. 4. До 5 мл водної витяжки додайте 5-10 крапель бромної води. 5. До 5 мл водної витяжки додайте 1 мл 10%-ної ацетатної кислоти і 5 мл 10%-ного розчину ацетату свинцю. Через декілька хвилин відфільтруйте осад. До 1 мл прозорого фільтрату додайте 1 мл 3%-ного розчину залізоамонійного галуну і 0,5 г кристалічного ацетату натрію. | Утворюється аморфний жовто- білий осад (за-гальна реакція на дубильні речови-ни). З'являється темно-синій осад (дубильні речови- ни гідролізованоі групи)або темно- зелений осад (ду- бильні речовини конденсованої фупи). Утворюється аморфний осад (дубильні речови-ни гідролізованої групи). Утворюється аморфний осад (дубильні речови-ни конденсованої групи). Утворюється темно-зелене за-барвлення (ду-бильні речовини конденсованої групи). | |||
ЛЮМІНЕСЦЕНТНА МІКРОСКОПІЯ
Метод люмінесцентної мікроскопії використовується (де є доцільно) для визначення тотожності лікарської рослинної сировини. При розгляді рослинної сировини в ультрафіолетовому світлі можна спостерігати характерну люмінесценцію в залежності від її хімічного складу. Перевага методу полягає в можливості його застосування для вивчення сухої лікарської сировини, з якої готують товсті зрізи або препарати порошку, та розглядають їх в падаючому світлі, при освітленні препарату зверху, через опак-ілюмінатор або об'єктив.
Люмінесцентна мікроскопія виконується за допомогою люмінесцентних мікроскопів або звичайних біологічних мікроскопів, обладнаних спеціальними люмінесцентними освітлювачами.
Приготування мікропрепаратів:
Для приготування мікропрепаратів використовують висушену лікарську рослинну сировину або її порошок. Попереднє розмочування сировини не допускається, оскільки це призводить до вимивання речовин з клітин, допускається лише нетривале розм'якшення у вологій камері.
Листки
Готують, як правило, препарати з порошків листків, які розглядають без застосовування рідини. Найбільш яскрава люмінесценція характерна для здерев'янілих елементів - судин жилки, механічних волокон, а також для кутикули та кутинізованих оболонок різних епідермальних утворів (волосків, залозок та ін.). В епідермальних клітинах часто містяться флавоноїди, що зумовлюють коричневу, жовту або зеленкувато-жовту люмінесценцію. Клітини мезофілу містять різноманітні включення - жовті, блакитні, зеленкувато-жовті, коричневі - в залежності від їх хімічного складу. Хлорофіл у висушеному рослинному матеріалі не створює люмінесценції.
При необхідності приготування зрізу листок попередньо розм'якшують у вологій камері і за допомогою леза роблять товстий зріз (2-Змм), який закріплюють на предметному склі пластиліном. Більш тонкі зрізи поміщають в рідину (що вказана) і накривають покривним скельцем.
Як середовище використовують воду, гліцерин, 5%-ний розчин полівінілового спирту, вазелінову олію, які не дають флуоресценції. Рідина не повинна розчиняти наявні в препараті люмінесцентні речовини.
Трава
При аналізі трав готують мікропрепарати листків. При необхідності приготування препарату стебла його розм'якшують у вологій камері та готують зрізи. Товсті зрізи (2-3 мм) закріплюють на предметному склі за допомогою пластиліну і розглядають без рідини, тонкі - поміщають у відповідну рідину та накривають покривним скельцем. Найбільш яскраву люмінесценцію мають здерев'янілі елементи провідних пучків - судини та механічні волокна, склеренхімні клітини, які зустрічаються в серцевині стебла. В клітинах епідермісу і нори є флавоноїди: у деяких видів обкладки, навколо провідних пучків містяться алкалоїди, яким властиве різноманітне свічення: синє, блакитне, зелене, зеленкувато-жовте. золотисто-жовте, оранжево-червоне, в залежності від складу.
Квіти
Частіше готують препарати з порошку пелюсток або окремих частин квітки (суцвіття), які розглядають, в основному, без рідини. В квітах часто містяться флавоноїди, каротиноїди та інші речовини, яким властива флуоресценція. Чітко спостерігаються пилкові зерна, які мають жовте, зеленкувато-жовте, блакитне свічення.
Плоди
Готують, як правило, поперечні зрізи плоду після попереднього розм'якшення у вологій камері і розглядають у вказаній вище рідині (середовищі) або без неї в залежності від товщини зрізу. Для плодів характерна люмінесценція тканин оплодню (екзокарпію, механічних клітин мезокарпію, провідних пучків). Чітко видно секреторні канали - яскраво світиться їх вміст; клітини вистиляючого шару звичайно мають жовтувато-коричневу люмінесценцію. У вмісті каналів нерідко зустрічаються з яскравою люмінесценцією кристалічні включення, найчастіше жовтого або жовтувато-зеленого кольору.
Насіння
Готують, як правило, поперечні зрізи насінин після попереднього розм'якшення і розглядають їх у вказаній вище рідині (середовищі) або без неї, в залежності від товщини зрізу. Звертають увагу на характер люмінесценції насінневої шкірки, в якій чітко виділяються склеренхімні шари. Клітини епідермісу, що містять слиз, звичайно мають синьо-блакитне світіння. Ендосперм і тканини зародку, багаті на жирну олію, характеризуються блакитною люмінесценцією.
Кора
Кору попередньо розм'якшують у вологій камері, готують товсті поперечні зрізи (до 3-5 мм), які закріплюють на предметному склі пластиліном і розглядають без рідини, тонкі зрізи поміщають у рідину. Для деяких видів сировини характерна люмінесценція коркового шару кори: оболонки клітин корку світяться інтенсивно-синім, їх вміст - темно-червоним (антоціани). Яскраве і різноманітне свічення мають механічні елементи (луб'яні волокна і кам'янисті клітини): блакитне, зеленкувато-блакитне, жовтувато-зелене. Люмінесценція паренхіми кори залежить від хімічного складу. Антраценпохідні зумовлюють яскраво оранжеве або вогненно-оранжеве забарвлення. Дубильні речовини мають властивість "гасити" люмінесценцію, тому тканини, що містять дубильні речовини, темно-коричневого, майже чорного кольору.
Корені, кореневища, цибулини, бульби, бульбо-цибулини.
Готують поперечні зрізи, розпили, препарати порошку або зіскобу. Зрізи готують з матеріалу, який попередньо розм'якшують у вологій камері, розпили (з жовтих коренів та кореневищ) - з висушеного матеріалу за допомогою тонкої пили. За допомогою леза з поверхні розпилу знімають тонкий шар для відкидання (усунення) шару клітин, вкритих пилом.
Товсті зрізи та розпили (до 3-5мм), закріплюють на предметному склі пластиліном і розглядають без рідини. Шар корку підземних органів, як правило, матовий, майже чорний. Яскраво люмінесціює деревина (в коренях та кореневищах) і провідні пучки, а також склеренхімні елементи. Їх свічення дуже різноманітне від буровато-зеленого, жовто-зеленого, до світло-блакитного та інтенсивно-синього в залежності від виду сировини. Ще більш різноманітна люмінесценція паренхіми тканин та різних секреторних утворів (вмістища, канали, ходи, молочники, різноманітні ідіобласти), що визначається їх хімічним складом. В секреторних утворах зустрічаються кристалічні включення кумаринів, алкалоїдів, флавоноїдів, яким властива яскрава люмінесценція.
В препаратах порошку зустрічаються окремі судини, групи механічних волокон, кам'янисті клітини, окремі секреторні утвори або їх частини, клітини паренхіми з яскравою люмінесценцією, що містять ті чи інші речовини. Препарати в люмінесцентному мікроскопі розглядають в ультрафіолетовому світлі, спостерігаючи первинну (власну) люмінесценцію.
ЛІТЕРАТУРА
Основна
1. Державна Фармакопея України / Державне підприємство «Науково-експертний фармакопейний центр». - 1-е вид.– Доповнення 2. – Х.: Державне підприємство «Науково-експертний фармакопейний центр», 2008. – 59 с.
2. Ковальов В.М., Павлій О.I., Ісакова Т.І. Фармакогнозія з основами біохімії рослин: Підручник для студ. вищих фармац. закладів освіти та фармац. факультетів вищих мед. закладів освіти ІІІ- Іv рівнів акредитації / За ред. В.М. Ковальова. – Х.: Прапор; Вид-во НФаУ, 2000,—703 с.
3. Методи визначення тотожності лікарської рослинної сировини різних морфологічних груп. Методичний посібник до лабораторних занять з фармакогнозії для студентів ІІІ курсу фармацевтичного факультету / Л.В. Бензель, А.Р. Грицик, Л.М. Грицик - . – Львів: Край, 2002. – 22 с.
4. Государственная фармакопея СССР: Вып. 2. Общие методы анализа Лекарственное растительное сырье/ МЗ СССР. — XI изд., доп. — М.: Медицина, — 1989. — 400 с.
5. Державна Фармакопея України / Державне підприємство «Науково-експертний фармакопейний центр». - 1-е вид. –Х.: РІРЕГ, 2001. – 556 с.
6. Державна Фармакопея України / Державне підприємство «Український науковий фармакопейний центр якості лікарських засобів». — 1-е вид. — Доповнення 3. — Х.: Державне підприємство «Український науковий фармакопейний центр якості лікарських засобів», 2009. - 280 с
7. Кузнецова М.А. Лекарственное растительное сырье и препараты. – М.:Высшая школа,1987.
8. Правила сбора и сушки лекарственных растений / Сборник инструкций /. – М.: Медицина,1985.
Додаткова
1. Муравьева Д. А. Фармакогнозия.- М.: Медицина, 1991.
2. Справочник по заготовках лекарственных растений / Д.С. Ивашин, З.Ф.Катина, И.З. Рыбачук и др. – Киев: Урожай,1989.
3. Лікарські рослини: Енциклопедичний довідник /Відп. ред. А.М. Гродзінський. – К.:Вид-во “Укр.енциклопедія” ім. М.П. Бажана,1992.
4. Соколов С.Я., Замотаев И.П. Справочник лекарственных растений (Фитотерапия). – М.:Медицина,1984.
5. Гаммерман А.Ф. Курс фармакогнозии. – Л.:Медицина,1967.