Тема 2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПОСТОЯННОГО ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА

Краткое содержание темы

Этапы приготовления постоянного гистологического препарата. Постоянный гистологический препарат - это изготовленный из тканей и органов объект, позволяющий узнать их структуру с помощью микроскопирования. Он может представлять собой тонкий срез органов, тотальный препарат (мягкая мозговая оболочка, рыхлая соединительная ткань), мазок (красный костный мозг, кровь и пунктат органа), отпечаток органов (печень, селезенка). Обработка объектов для приготовления из него постоянного гистологического препарата включает следующие моменты: (1) взятие материала, (2) фиксирование, (3) обезвоживание и уплотнение, (4) заливка в плотные среды, (5) изготовление срезов, (6) окрашивание, (7) просветление и заключение в среду, служащую для сохранения препаратов. Взятие материала: объекты, подлежащие исследованию, забираются как можно раньше после забоя животного и сразу же фиксируются или замораживаются для сохранения структуры органов. В некоторых случаях пользуются иссечением тканей из живого организма (биопсия) с целью диагностического морфологического исследования. Иссечение кусочков проводится острым инструментом (бритвы, секционные ножи) во избежание повреждения тканей. Ножницами пользуются при иссечении оболочек (сальник, мягкая мозговая оболочка) и тонкостенных полых органов (желчный пузырь, кишечник). Кусочки из костей выпиливают, иссекают с учетом микроскопического строения того или иного органа или тканей величиной 1-1,5 см3; например, почки и надпочечник вырезают с таким расчетом, чтобы в них попали корковое и мозговое вещество, для чего разрезы ведут перпендикулярно поверхности органов. Из органов, имеющих во всех частях одинаковое строение (печень, селезенка) объекты можно иссекать в любом участке, но желательно с капсулой. Кусочки из патологически измененных тканей (опухоли, язвы) вырезают на границе с нормальными тканями так, чтобы были захвачены и нормальные, и измененные участки.

Фиксация. Цель фиксации - закрепление и сохранение тканевых структур в том виде, в котором они находились в момент забора материала. Это достигается коагуляцией белков фиксирующими жидкостями, которые должны достаточно быстро проникать в ткани и действовать «мягко», не вызывая грубых нарушений тканевых структур (например сморщивание, чрезмерное уплотнение). К фиксирующим жидкостям относят формалин, спирт, слабые растворы уксусной, азотной, хромовой и других кислот, сулему, двухромовокислый калий. Фиксаторы, состоящие из какого-либо одного вещества, называются простыми фиксаторами. Чаще применяются сложные фиксаторы, состоящие из смеси нескольких простых фиксирующих компонентов. Так, например, раствор Буэна включает уксусную, пикриновую кислоты и формалин, жидкость Ценкера состоит из двухромовокислого калия и сулемы, а жидкость Мюллера - это смесь двухромовокислого калия, сульфата натрия в воде. Выбор фиксатора зависит от характера объекта и цели, которая ставится при изготовлении препарата. Например, чтобы сохранить в клетках включения жира, следует применять формалин, а не спирт, т.к. он является растворителем жира. В то же время этиловый спирт - наилучший фиксатор при исследовании в клетках железа, гликогена и нуклеиновых кислот. После фиксации кусочки промывают водой, если фиксатор содержит вещество, мешающее дальнейшей обработке (сулема, формалин). Если таких веществ нет (спирт или смеси, содержащие спирт), то кусочки не промываются.

Обезвоживание. Уплотнение. Обезвоживание исследуемого образца производят в спиртах возрастающей концентрации (50°, 60°, 70°, 80°, 90°, 100°) с целью уплотнения ткани и подготовки ее к пропитыванию целлоидином или парафином. В каждом спирте исследуемый образец выдерживают не менее суток.

Заливка. Для того чтобы из кусочка можно было приготовить срез, необходимо придать ему еще более плотную консистенцию. Для этих целей применяются парафин и целлоидин. Принцип заливки заключается в последовательном проведении кусочка через ряд жидкостей, из которых каждая предыдущая должна обладать способностью смешиваться с последующей. Схема заливки в парафин состоит в следующем; 1) спирт 100° - 1-2 часа; 2) смесь 100° спирта и ксилола 1:1 - до погружения кусочка; 3) ксилол (хлороформ) 1 час; 4) раствор парафина в ксилоле - 0,5-1 час; 5) расплавленный парафин (воск) 1-2 часа. Время каждого этапа заливки вместе с тем определяется особенностями объекта. После пребывания в расплавленном парафине в термостате при температуре 37°С - 1-2 часа или при 56°С - 0,5-1 час образец полностью пропитывается парафином. В целях полного освобождения объекта от ксилола кусочки проводят последовательно через 2-5 порций расплавленного парафина. Затем кусочек вместе с расплавленным парафином помещают в формочку, где он застывает при комнатной температуре в плотный блок.

Схема заливки в целлоидин состоит в последовательной проводке материала в 100° спирте, смеси спирта и эфира, 5% целлоидине. В каждом растворе целлоидина образец выдерживают от 3 до 7 дней, после чего кусочек вследствие испарения спирта и эфира застывает в плотный гель. Это позволяет нарезать исследуемый образец с прилежащим целлоидином и наклеить его на деревянный брусок. Таким образом, парафиновые блоки могут сохраняться длительное время, а целлоидиновые помещают в 70° спирт для сохранения. Наряду с названными уплотняющими средствами, в настоящее время применяют синтетические смолы и полимеры (например, поливакс, карбовакс или полиэтиленгликоль).

Изготовление срезов. Из залитых целлоидиновых и парафиновых блоков готовят срезы необходимой толщины (5-10 мкм) на специальных приборах различной конструкции - микротомах. Наиболее распространенным является санный микротом (МС-2), в котором нож и объектодержатель движутся на специальных салазках. Основные части микротома: 1) станина - массивная чугунная основа, на которую монтируются все остальные узлы; 2) механизм подъема; 3) зажим для блока; 4) ножевые салазки, несущие на себе ножедержатель. Последний укрепляется на салазках рукояткой, позволяющей менять горизонтальный угол расположения ножа. Зажим снабжен подвижной цилиндрической втулкой, перемещение которой с помощью винта меняет угол наклона ножа; 5) механизм микропередачи состоит из стержня, соединенного с тягой храповика микро-пинта. Эта система поднимает столик с объективом на высоту, соответстнующую толщине среза, а движущийся в горизонтальной плоскости нож режет блок. При необходимости получения препарата в короткий срок (например, с диагностической целью) используется замораживающий микротом или криостат. Первый построен по санному принципу, но имеет особенности конструкции и монтажа. Основные его узлы: станина, механизм подъема, бритводержатель и замораживающий столик. Криостат, в свою очередь, представляет собой холодильник, в рабочей камере которого установлен микротом. Сравнительно небольшой объем камеры, надежная теплоизоляция, наличие специального регулирующего механизма позволяют поддерживать постоянно заданную минусовую температуру. Таким образом, уплотнение материала при резке на замораживающем микротоме и криостате достигается замораживанием образца.

Окрашивание. С тех пор, как было установлено, что отдельные составные части клеток и межклеточные элементы по-разному воспринимают и удерживают красители, было предложено большое количество окрасок препаратов. Хотя до настоящего времени полностью не выяснена сущность механизмов действия многих красителей, несомненно, что в основе окрашивания микроструктур лежат физико-химические процессы. Из физических факторов следует отметить диффузию, адсорбцию (поверхностное впитывание) красителя, а также его растворимость, из химических -электролитические свойства красящих веществ в самих тканях. Немаловажное значение имеет плотность тканей и дисперсность самого красителя. Первое свойство определяет последовательность окраски отдельных структур, второе - скорость процесса окраски. На электролитических свойствах основано разделение применяемых в гистологической практике красителей на три группы: основные, кислые и нейтральные. Основной краситель представляет собой красящее основание или его соль и окрашивает клеточные и тканевые структуры кислой природы (например, хроматин, ядра, содержащие ДНК, ядрышко, содержащее РНК). Отсюда и термин - базофилия (любящий основание) для обозначения тканевых компонентов, окрашивающихся красителями, таким как тионин, гематоксилин, метиловый зеленый, кармин, азур, сафранин и др. Кислотный краситель - это красящая кислота и ее соль, в силу чего она окрашивает вещества и частицы основной природы, например гранулы эозинофильных лейкоцитов, цитоплазму большинства клеток. Отсюда оксифилен для тканевых элементов, красящихся кислотными красителями, к которым относятся эозин, кислый фуксин, конго красный, анилиновый синий и др. Нейтральный краситель образуется при соединении водных растворов кислотного и основного красителя, например судан-3, эозиновокислый метиленовый синий. Кроме того, в гистологической практике часто используются специальные красители. Так, например, для выявления жира применяется судан-3 и шарлах красный. Первый окрашивает жир в желтый, а второй - в оранжевый цвет. Осмиевая кислота окрашивает жиры в черный цвет. Эластические волокна при обработке орсеином окрашиваются в коричневый цвет, резорцин фуксином в темно-синий цвет, а пикро-фуксин окрашивает их в желтый цвет. Для выявления нервных элементов, клеточных границ и органоидов в различных тканях применяется импрегнация (пропитывание) раствором азотистокислого серебра, осмиевой кислоты, хлорного золота, основанная на восстановлении свободных металлов и осаждении их на исследуемых структурах.

Просветление и заключение. Сохранение прозрачности, окраска и структурная целостность постоянного гистологического препарата обеспечивается просветлением и заключением препарата в специальные среды. Средой для заключения служат смола канадской основы (канадский бальзам) и пихтовая смола, употребляющиеся в виде густых растворов этих смол в ксилоле. Применение их при предварительном обезвоживании абсолютным спиртом и просветлении ксилолом. При отсутствии смол можно пользоваться дамарным лаком (60% раствор смолы деревьев рода произрастающих в Индии) или раствором канифоли в спирте, который получают из различных видов сосны. В тех случаях, когда по условиям обработки препарат не может соприкасаться со спиртом, ксилолом и т.п. (например, окраски на жиры) его заключают в среды (глицерин, глицерин-желатин), которые, кроме того, обладают просветляющими свойствами. Например, широко распространенными методами окраски препаратов является окраска гематоксилин-эозином и по Ван-Гизону.