Методы исследования гемостаза
Факторы, определяющие тромборезистентность эндотелия
Контактная инертность внутренней, обращенной в просвет сосуда поверхности этих клеток, в силу чего она не активирует системы гемостаза;
Синтез мощного ингибитора агрегации тромбоцитов - простагландина I2 (простациклина).
Наличие на цитоплазматической мембране эндотелиальных клеток особого гликопротеина - тромбомодулина, связывающего тромбин, благодаря чему последний утрачивает способность вызывать свертывание крови, но сохраняет активирующее действие на систему двух важнейших антикоагулянтов - протеинов С и S.
Высокое содержание на внутренней поверхности кровеносных сосудов мукополисахаридов и фиксацией на эндотелии комплекса «гепарин-антитромбин III».
Способность стимулировать фибринолиз путем синтеза и секреции тканевого активатора плазминогена, а также через систему «протеины С+S»
Элиминаця из крови активированных факторов свертывания крови и их метаболитов.
Трансформация антитромботического потенциала эндотелия на тромбогенный происходит
При застое крови.
При гипоксии.
При повреждении стенок сосудов физическими и химическими агентами.
Под влиянием экзо- и эндотоксинов, среди которых главенствующую роль играют бактериальные эндотоксины.
иммунные комплексы.
Антиэндотелиальные и антифосфолипидные антитела.
Медиаторы воспаления (интерлейкины, фактор некроза опухоли и др.).
Клеточные и плазменные протеазы (эластаза, трипсин, тромбин и др.).
При метаболических изменениях сосудистой стенки (атеросклероз, диабетическая ангиопатия).
В сосудистом гемостазе принимают участи следующие простагландины:
простациклин (ПГI2) - стимулирует аденилатциклазу, цАМФ, расширяет сосуды;
тромбоксан (ПГА2) - ингибирует аденилатциклазу, цАМФ, вызывает спазм.
Тромбоцитарный гемостазвключает:
адгезию - прилипание к стенке (тромбоксан А2, коллаген (положительно заряженные аминогруппы), фактор Виллебранда, аденозин).
агрегацию - склеивание (коллаген, тромбоксан А2, адреналин, АДФ).
уплотнение (ретракцию) - тромбостенин.
образование тромбоцитарного (белого) тромба, его достаточно для начала гемостаза и незамедлительной остановки кровотечения, но сам по себе он не в состоянии поддерживать гемостаз.
Функции тромбоцитов
Ангиотрофическая, т.е. поддержание нормальной структуры и функции стенок микрососудов, в том числе жизнеспособность и репарацию эндотелиальных клеток.
Поддержание спазма поврежденных сосудов путем высвобождения вазоактивных веществ – серотонина, катехоламинов, тромбомодулина и др.
Образование в поврежденном сосуде тромбоцитарной пробки.
Участие тромбоцитарных факторов в процессе свертывания крови и в регуляции фибринолиза.
Стимуляция процесса репарации в местах повреждения сосудистой стенки выделяющимся из подвергшихся адгезии тромбоцитов ростовым фактором.
Реакция высвобождения – выброс из гранул тромбоцитов биологически активных веществ (АДФ, серотонин, адреналин, тромбоксан), факторов тромбоцитов (3, 4), а также факторов свертывания, адсорбированных на поверхности тромбоцитов.
Плазменный (коагуляционный гемостаз)
Свертывающая система крови – это несколько взаимосвязанных каскадных реакций, протекающих при участии протеолитических ферментов. На каждой стадии каскада профермент (зимоген) превращается в сериновую протеазу, которая катализирует превращение следующего профермента в сериновую протеазу и так далее. 13 таких белков составляют систему свертывания.
Стадии коагуляционного гемостаза:
Образование активной протромбиназы.
Образование тромбина (2-5 с).
Образование фибрина (красный тромб) - 3-5 с.
Пути активации свертывания крови
Механизмы активации свертывания крови подразделяют на внешние и внутренние. Это деление искусственно, так как оно не имеет места in vivo, но облегчает интерпретацию лабораторных тестов in vitro.
Основным путем активации свертывания крови считается внешний путь.
Он начинается с высвобождения тканевого фактора (ФIII или ТФ). ТФ образуется во многих клетках, имеющих контакт с кровью и поступает в нее при повреждении клеток или действии протеаз. ТФ в присутствии ионов Са++ активирует фактор VII. Профермент ФVII синтезируется в печени, является витамин К-зависимым.
Комплекс ТФ/ФVIIа/Са++ действует на два субстрата ФX и ФIX.
Внутренний путь начинается с обнажения отрицательно заряженной поверхности (например, коллагена) в пределах сосудистой стенки, следствием этого является активация ФXII. ФXIIа вызывает активацию прекалликреина (ПК), высокомолекулярного кининогена (ВМС) и ФXI. ФXIIа расщепляет ФXI до ФXIа и ПК до калликреина.
ФXIа превращает ФIX в ФIXа (протромбиназа).
Таким образом, ФIX активируется ФXIа или комплексом ТФ/ФVIIа/Са++, последний является более важным.
ФIXа требует наличия Са++ и кофактора ФVIII для прикрепления к тромбоцитарному фосфолипиду и превращения ФX в ФXа.
ФVIII циркулирует в крови в связанном с ФВ состоянии. Это стабилизирует его молекулу, увеличивает период его полужизни и способствует его транспорту к месту повреждения (так как ФВ способен связываться как с субэндотелием, так и со стимулированными тромбоцитами).
Рис. 6.1. Схема внешнего пути коагуляционного гемостаза (1 фаза коагуляционного гемостаза).
Рис. 6.2. Схема внутреннего пути коагуляционного гемостаза (1 фаза коагуляционного гемостаза).
Общий путь. ФXа связан с ФVа на фосфолипидной поверхности и в присутствии Са++ превращает протромбин (ФII) в тромбин (ФIIа).
Рис. 6.3. Схема образования тромбина (2 фаза коагуляционного гемостаза).
Тромбин вызывает гидролиз фибриногенадо фибрина. Фибриноген синтезируется в основном гепатоцитами, но имеется в мегакариоцитах и тромбоцитах. Его синтез индуцируется повреждением тканей, воспалением, стрессом.
Тромбин расщепляет фибриноген до двух пептидов и мономера фибрина. Эти мономеры образуют полимер фибрин I (solubile), удерживаясь водородными связями - это растворимые фибриновые комплексы. Последующий гидролиз этих комплексов под действием тромбина приводит к выделению фибринопептида В. Тромбин активирует ФXIII, который в присутствии Ca++ связывает боковые цепи полимеров. Образуется сеть фибриновых волокон фибрин II (insolubile), что прочно удерживает тромбоцитарную массу на месте травмы.
Рис. 6.4. Схема образования фибрина (3 фаза коагуляционного гемостаза).
Антикоагулянты
Большинство из них относятся к серпинам.Серпины (ингибиторы сериновых протеаз - «serine protease inhibitor»)
I. Предшествующие (первичные):
Антитромбин III (гепариновый кофактор 1) - ингибитор тромбина, ФXа, ФIXа, ФXIа, ФXIIа. 75-90 % антикоагулянтной активности. Эффект АТ II потенцируется гепарином.
Рис. 6.5. Схема эффектов антитромбина III.
Гепарин - синтез в тучных клетках. Действует только при наличии АТ III.
a2-макроглобулин (около 3% антитромбиновой активности).
a1-антитрипсин - нейтрализует ФXIа и активированный протеин С.
С1-ингибитор - 95% ФXIа и более 50% всего калликреина. Дефицит его приводит к ангионевротическому отеку.
Протеин С - инактивирует ФVа и ФVIIIа.
Протеин S - кофактор протеина С.
Тромбомодулин – гликопротеид, фиксированный на цитоплазматической мембране эндотелия. Связывает и инактивирует тромбин, но не ослабляет его активирующего действия на протеин С.
Рис. 6.6. Схема эффектов гепарина.
II. Образующиеся (вторичные):АТI (фибрин), ПДФ.
Фибринолиз
1. Фибринолитическая активность плазмы определяется:
плазминоген
плазмин
активаторы плазминогена
ингибиторы плазминогена
Рис. 6.7. Схема фибринолитической системы.
Активаторы плазминогена образуются сосудистой стенкой (внутренняя активация).
Внутренний путь активации включает активацию белков контактной фазы:
факторов XII, XI,
прокалликреина,
высокомолекулярного кининогена
калликреина.
Внешняя активация происходит в результате действия
тканевого активатора плазминогена (ТАП)
урокиназы.
Нефизиологические активаторы плазминогена:
стрептокиназа (гемолитический стрептококк)
антистреплаза (комплекс человеческого плазминогена и бактериальной стрептокиназы)
стафтлокиназа (золотистый стафилококк)
Ингибиторы плазмина:
a2-антиплазмин (серпин)
a2-макроглобулин
a1-антитрипсин
АТ III
С1-ингибитор
ингибиторы активатора плазминогена 1, 2, 3
· Клеточная фибринолитическая система связана с лейкоцитами, макрофагами, ЭК и тромбоцитами.
Методы исследования гемостаза
Сосудисто-тромбоцитарный гемостаз
Время кровотечения по Дьюку (мочку уха согревают, глубина прокола стандартным ланцетом 3,5 мм, промокание через 15-30 с, норма – 2-5 мин).
Более точно с помощью пробы Айви - по определению времени и объема кровотечения из проколов на ладонной поверхности предплечья на фоне венозного стаза, вызванного сдавлением плеча манжетой для измерения АД и поддержания давления в ней на уровне 40 мм рт.ст. В этой пробе остановка кровотечения при нормальной функции тромбоцитов происходит в первые 5-8 минут.
Подсчет количества тромбоцитов (N 150 - 400*109/л). Тромбоцитоз и тромбоцитопения.
Гемолизат-агрегационный тест. Добавляют «естественный» ингибитор агрегации тромбоцитов - гемолизат эритроцитов в различных концентрациях. Результаты по таблицам. Норма 11-17 с. Укорочение – усиление агрегации тромбоцитов, удлинение – снижение.
Коагуляционный гемостаз
Общая способность к свертыванию: время свертывания по Ли-Уайту. 8-12 мин. Гипер-, гипокоагуляция.
Тромбиновое время (добавление тромбина) N 14-16 с. Гипер- гипокоагуляция.
Внешний путь - пробромбиновое время по Квику. Тканевой тромбопластин добавляют к рекальцифицированной цитратной плазме (N 10-18 с.). Протромбиновый индекс (по отношению к стандартной плазме) 90-105%, или протромбиновое отношение - 0,7-1,1. Активация и торможение по внешнему пути.
Внутренний механизм - активированное парциальное (частичное) тромбопластиновое время (АЧТВ). Определяют время свертывания рекальцифицирования плазмы в условиях стандартной активации фосфолипазами (кефалином) и контактом (каолином) N 30-40 c. Выявляют дефицит факторов внутреннего механизма свертывания при удлинении времени, или активацию внутреннего пути при укорочении.
Диагностика скрытой коагуляции. (растворимые фибрин-мономерные комплексы) - этаноловый тест и фенантролиновый тест. Выявляет фибрин мономерные комплексы (фибрин М и ПДФ). Этаноловый тест - качественный (желеобразный сгусток через 10 мин). Фенантролиновый - количественный (положительный при появлении хлопьев в первые 150 с - количество по таблице).
Тромбофилии, связанные с повышением активности тромбоцитов и повреждением сосудистой стенки.