Углеводы, полисахариды

Углеводы присутствуют во всех растениях и извлекаются водой, водными спиртами, другими водно-органическими растворителями при нагревании.

Они могут быть в свободном состоянии или в составе гликозидов. Все углеводы делят на моно- и полисахара.

Полисахариды (гомо-, гетеро-) – высокомолекулярные соединения углеводов. Некоторые из них нерастворимы в воде (клетчатка), другие набухают в теплой воде (крахмал), образуют полуистинные и коллоидные растворы (слизи, пектины, камеди):

Инулин – растворимый в воде высокомолекулярный фруктозан, накапливающийся, главным образом, в подземных органах (одуванчик, цикорий, девясил, топинамбур и др.).

Слизи по химической природе близки к камедям, но отличаются значительным преобладанием в них пентозанов и хорошей растворимостью в воде.

Полисахариды обладают высокой противовоспалительной и иммуномодулирующей, противоопухолевой и антиметастати-ческой активностью, играют существенную роль в обмене веществ. Характер биоактивности и ее величина зависят от их природы (гомо- и/или гетерополисахариды) [7-9].

От этих факторов зависит и их растворимость в воде, щелочах, кислотах, водно-органических растворителях.

Выделение:

Около 2-3 г измельченного растительного сырья заливают 30 мл воды очищенной или спирта этилового 10-30%, оставляют на 10-12 часов, периодически перемешивая. Затем нагревают на водяной бане в течение 30-40 мин, фильтруют.

Качественный анализ:

реактивы
Р-я Бейт-Смита и Уэстолла. AgNO3	+	+	+	+	+	-	+	+	-
Хлористый трифенилдиазолий, 3% водный	+	+	+	+	+	-	+	-	-
Перйодат – бензидин	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Р-я Селиванова. Резорцин	син	-	+	кр	ж	кр	-	-	-
Перйодат – KMnO4 - бензидин	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Антрон	-	-	-	+	-	+	+	-	-
Кислый фталат анилина	кр	кор	-	-	кор	-	+	-	-
Анилин – дифениламин	+	+	+	+	+	+	+	-	-
Нингидрин	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Р-я Бояркина. о-толуидин	+	+	+	+	+	-	+	-	-
Мочевина	-	+	+	+	-	-	-	+	-
Р-я Молиша	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Р-я Келлер- Килиани	+	+	+	+	+	-	+	-	+
Р-р Фелинга, нагревание	+	+	+	+	+	-	+	-	-

Продолжение таблицы

реактивы								цвет
Р-я Бейт-Смита и Уэстолла. AgNO3	+	-	-	+	+	-	+	черн
Хлористый трифенилдиазолий, 3% водный	+	-	-	-	-	-	+	крас
Перйодат – бензидин	+	+	+	+	+	+	+	бел
Р-я Селиванова. Резорцин	+	-	-	-	+	-	-	разн
Перйодат – KMnO4 - бензидин	+	+	+	+	+	+	+	син
Антрон	-	-	-	-	-	+	-	желт
Кислый фталат анилина	+	-	-	+	+	+	+	разн
Анилин – дифениламин	+	-	-	-	-	+	+	разн
Нингидрин	-	-	-	-	-	-	+	фиол
Р-я Бояркина. о-толуидин	-	-	-	+	+	+	+	разн
Мочевина	+	-	-	+	+	+	+	разн
Р-я Молиша	+	+	+	+	+	-	+	фиол
Р-я Келлер- Килиани	+	+	син	+	+	+	+	разн
Р-р Фелинга, нагревание	+	-	+	+	+	-	+	разн

1 = альдопентозы; 2 = альдогексозы; 3 = кетопентозы; 4 = кетогексозы; 5 = метилпентозы; 6 = невосстанавливающие дисахариды; 7 = восстанавли-вающие дисахариды; 8 = сахароспирты; 9 = невосстанавли-вающие кислоты; 10 = уроновые и кетокислоты; 11 = лактоны; 12 = дезоксисахара; 13 = метилированные альдозы; 14 = метилированные кетозы; 15 = фосфорные эфиры; 16 = аминосахара

Все полисахара делят на олиго- (от 2 до 10 углеводных единиц) и высшие полисахара (более 10 углеводных единиц) линейного и разветвленного строения. Поэтому они дают все реакции углеводов и только некоторые реакции, приведенные ниже, позволяют провести их групповую идентификацию (слизи, крахмал, инулин и др.).

q Добавляют 1-3 капли 0.125% водного или спиртового раствора толуидинового синего, появляется красное на синем фоне окрашивание (полисахариды со свободными СООН-группами).

q Добавляют 1-5 капель раствора муцикармина, появля-ется красно-карминовое окрашивание (смесь нейтральных и кислых полисахаридов).

q Добавляют 1-3 капли свежеприготовленного спиртово-кислого раствора орто- или пара-аминофенола, подогревают до 100⁰С, появляется яркое окрашивание (полисахариды, инулин, альдозы и кетозы).

q Добавляют 1-2 капли раствора 1% йода, появляется сине-фиолетовое окрашивание (крахмал). Слизи и инулин этой реакции не дают!

q Добавляют 1-3 мл кислоты хлороводородной концентри-рованной, появляется коагуляция или желто-зеленое окраши-вание (слизи).

q Добавляют 3-5 мл спирта этилового 95%, появляется коагуляция, затем при стоянии - осадок (слизи). Если осадок выпадает сразу (полисахариды).

q Добавляют несколько капель 20% спиртового раствора альфа-нафтола, затем, не перемешивая, несколько капель кислоты серной концентрированной, появляется фиолетово-розовое окрашивание (инулин, крахмал), коричневое (дисахара).

q Добавляют несколько капель 20% раствора резорцина и кислоты серной концентрированной, появляется красное окрашивание (инулин, крахмал).

q Добавляют несколько капель 20% спиртового раствора тимола и кислоты серной концентрированной, появляется розовато-малиновое окрашивание (инулин, крахмал), коричневое (дисахара).

q Добавляют 1-3 мл раствора аммиака или натрия гидроксида, появляется лимонно-желтое окрашивание (слизи).

q Добавляют 1-2 капли раствора азотнокислого серебра аммиачного, появляется черное окрашивание (альдозы, карбоновые кислоты).

q Добавляют 1-3 капли реактива анилинфталатного, появ-ляется различное окрашивание (полисахариды, гликопротеиды, аминосахара).

Хроматографический анализ:

Для разделения и качественного анализа моно-, олиго- и полимерных сахаров используют различные хроматографи-ческие методы. Если для идентификации мономерных сахаров часто является достаточным проведение лишь сравнительного качественного хроматографического анализа на бумаге или в тонком слое с аутентичными образцами, то для непосредствен­ного анализа смеси высокомолекулярных веществ (олиго- и полисахаридов) в виду ограниченной растворимости этих веществ в органиче­ских растворителях эти методы не применимы.

Выбор хроматографической системы для анализа мономерных сахаров на бумаге определяется природой этих компонентов. Для анализа сахароспиртов чаще всего применяют следующие системы: н-бутанол - уксусная кислота - вода (5:2:1), н-бутанол - этанол - вода (4:1:5) или н-пропанол - этилацетат - вода в соотношении 7:1:2. Для сахарных кислот наиболее пригодными оказались следующие системы: н-бутанол - уксус­ная кислота - вода в соотношении 4:1:5, н-пропанол – метилбензоат - муравьиная кислота -вода в соотношении 7 : 3 : 2 : 5, а для лактонов - н-бутанол – этанол - вода (4:1,1:1,9). Дезоксисахара чаще всего разделяют в системе: н-бутанол - этанол - вода (4:1:5); ангидриды сахаров в системах: н-бутанол – пиридин - вода в соотношении 3:2:1 или этилацетат - пиридин - вода (25:8:7). Для разделения аминосахаров, чаще всего, применяют щелочные системы, в которых аминосахара продвигаются медленнее, чем соответствующие им незамещенные сахара. Наиболее применимой системой является коллидин, насыщенный водой; эта система пригодна для отделения глюкозамина от галактозамина. Приемлемой может оказаться также система: пиридин - этилацетат - уксусная кислота - вода (5:5:1:3). Для разделения альдоз, кетоз и их метильных производных чаще всего применяют систему н-бутанол – этанол - аммиак - вода в соотношении 4 : 10 : 1 : 49 или н-бутанол - этанол - вода в соотношении 5:1:4.

При ВЭЖХ анализе олиго- и полисахаридов используются силикагели со средним диаметром частиц 5-10 мкм, с которыми химически связана неполярная фаза, например, октадецил-силильная (Сферисорб ODS-2, Нуклеосил 100-C₁₈, Vydac C₁₈, Bondapak C₁₈ и др.), полярные фазы, аминопропилсилильные (Lichrosorb NH₂, m-Bondapak NH₂ и др.).

При анализе нейтральных олиго- и полисахаров, наиболее применима вода, в качестве подвижной фазы; для анализа перметилированных сахаров оптимальной подвижной фазой может считаться 70% водный ацетонитрил; для анализа ацилированных форм олиго и полисахаров используется линейный градиент концентрации подвижной фазы ацетонитрил-вода от 10 до 70% ацетонитрила; кислые сахара принято делить в той же хроматографической системе с соотношением компонентов 1:1. Наиболее широко используемым для детектирования в ВЭЖХ олиго- и поли-мерных сахаров является дифференциальный рефрактометр, либо УФ детектор при длине волны 192 нм.

Для ионообменной хроматографии полисахаридов чаще всего используются Carbo Pac PA-1 или Cyclobond I в качестве неподвижной фазы. Оптимальной подвижной фазой в анализе нейтральных поли- и олигосахаров является смесь: 75мМ натрия ацетата и 0.15М натрия гидроксида. Исследование N-замещенных сахаров принято проводить при линейном градиенте подвижной фазы: 1М натрия гидроксид - 1М натрия ацетат – вода от 10:2:88 до 10:14:76. Высокоэффективными в анализе кислых полисахаров признаны системы: 100мМ натрия гидроксида - 300мМ натрия ацетата и ацетонитрил - натрий ацетатный буферный раствор (100мМ, рН 5.0).

В ГФ Х1 изд. для количественного определения полисахаридов используется гравиметрический метод. Этот метод использован в фармакопейных статьях на траву алтея, мукалтин, коровяка цветки, череды траву, льна и тыквы семена, подорожника листья, слоевище ламинарии и др.

Перечисленные ФС повторяют стадию извлечения поли-сахаридов водой от 3 до 7 раз при нагревании от 1.5 до 7 часов, общий объем извлечения от 250 до 500 мл.

Если это препарат – его растворяют в определенном объеме воды, чаще 1:5(10) при нагревании на водяной бане в течение 30 минут (1 часа).

На этой стадии – водные извлечения либо фильтруют, либо центрифугируют. Это связано только со степенью измельчения сырья, т.е. для тонких порошков нужно фугировать извлечения, либо фильтровать через несколько слоев фильтрующих материалов.

II стадия (осаждение) – полисахариды осаждают спиртом этиловым 95-96% в соотношении от 1:1 до 1:3(5). Если полисахаридов много в сырье, спирта на их осаждение нужно брать меньше. Например, в траве алтея, мукалтине, ламинарии осаждение проводят в соотношении 1:1. Аликвота может быть от 10 до 25 мл (реже 50 мл).

III стадия (отделение осадка полисахаридов) – для лучшего и полного осаждения рекомендуется нагревание в течение 5(10) минут на водяной бане при 50-60⁰С.

При этом сумма полисахаридов, как правило, выпадает в осадок в виде тонко дисперсного порошка, и на этой стадии его отделение достигается центрифугированием в течение 30 минут при 3000-5000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок сушат до постоянного веса при температуре от 90 до 105⁰С.

Поскольку в методиках общий объем извлечения колеблется от 250 до 500 мл, аликвота на осаждение составляет 10-50 мл (чаще 25 мл). Если анализ выполняется в трехкратной повторности, необходимо 75 мл извлечения, значит, необхо-димый фиксированный объем анализируемого извлечения может быть 100 мл. Отсюда следует, что извлечение целесо-образнее проводить при соотношении сырье:вода 1:5, 5 раз по схеме: 1 час + 4 раза по 30 минут кипения на водяной бане.

Целесообразно сократить навеску анализируемого сырья, вместо 10 г брать 1-2 г, тогда на извлечение достаточно будет брать 25 мл воды. В этом случае будет использована более доступная посуда емкостью 100 мл, как на стадии извлечения, так и для сбора извлечений.

На стадии получения извлечения нет необходимости центрифугирования, достаточно фильтрации, это упростит методику.

Если использовать навеску сырья 1-2 г, получив 100 мл извлечения, то в 3 параллельных анализах потребуется: 90 мл спирта (аликвота 10 мл); 225 мл спирта (аликвота 25 мл). Такая разница в количестве спирта имеет большое значение.

К сожалению, гравиметрический метод не является достаточно точным, поскольку вместе с полисахаридами осаждаются пектины, а гетерополисахариды кислотного типа спиртом не осаждаются [7,109,110].

Поэтому, в зависимости от растения и наличия в нем пектиновых веществ, результаты будут завышенными, а в случае присутствии в растении гетерополисахаридов с уроновыми кислотами – результаты анализов по этой методике будут заниженными.

В научной литературе описано еще более 10 различных методов количественного определения полисахаридов, более или менее специфичных относительно их химической природы (с использованием стадии гидролиза полисахаридов и без таковой, спектрофотометрический, с использованием реакции с фенолом или антроном).

Последний, в присутствии кислоты серной концентри-рованной, является специфичным реактивом на полисахариды и наиболее точно соответствует их химической природе.

В методике расчета можно использовать коэффициент пересчета на глюкозу или построить калибровочный график по углеводу, который является мономером полисахарида. Методика построения калибровочного графика приведена ниже, а в формуле расчета можно поставить «С» - концентрацию другого углевода, найденную по калибровочному графику.

Примечания. Построение калибровочного графи-ка по растворам глюкозы. 0.14 г (точная навеска) глюкозы, высушенной до постоянной массы при температуре 100-105⁰С, растворяют в мерной колбе вместимостью 100 мл в воде очищенной, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают (0.0014 г/мл).

1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают (исходный раствор).

1 мл полученного раствора содержит 0.000056 г глюкозы (56 мкг).

К 0.8 мл раствора прибавляют 0.2 мл воды очищенной, полученный раствор содержит 44.8 мкг глюкозы, к 0.6 мл раствора прибавляют 0.4 мл воды очищенной, полученный раствор содержит 33.6 мкг глюкозы и т.д.

В 5 пробирок вносят 0.2; 0.4; 0.6; 0.8; 1.0 мл исходного раствора; прибавляют соответственно 0.8; 0.6; 0.4; 0.2; мл воды очищенной. Затем в каждую пробирку прибавляют по 2 мл 0.2% раствора антрона в кислоте серной концентрированной, охлаждают до температуры 10-15⁰С, затем нагревают на кипящей водяной бане в течение 20 минут, охлаждают и определяют оптическую плотность раствора при длине волны 625 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют смесь 1 мл воды очищенной и 2 мл 0.2% раствора антрона в кислоте серной концентрированной, выдержанную в тех же условиях, что и растворы с глюкозой.

По полученным данным строят график зависимости оптической плотности растворов от содержания глюкозы в мкг/мл [70].

Для оценки содержания полисахаридов в фитопрепаратах воспроизводимые результаты дает метод 1.

Метод 1. Около 1 г препарата (точная навеска) помещают в плоскодонную колбувместимостью 50 мл, прибавляют 10 мл кислоты хлороводородной 10% и кипятят с обратным холодильником в течение 1 часа. Колбу с содержимым охлаждают, опускают в нее небольшой кусочек бумаги конго и прибавляют по каплям 40% раствор натрия гидроксида до покраснения бумаги; затем прибавляют несколько капель разведенной соляной кислоты до посинения бумаги, а затем 10% раствор натрия гидроксида до покраснения бумаги. Раствор переносят количественно в мерную колбу вместимостью 50 мл, промывают колбу водой, доводят объем раствора водой до метки, перемешивают и фильтруют, отбрасывая первые 15-20 мл фильтрата.

В две плоскодонные колбы вместимостью 50 мл отмеривают пипеткой 2.5 мл 1% раствора пикриновой кислоты, 7.5 мл 20 % раствора карбоната натрия. В одну колбу прибавляют 5 мл испытуемого, в другую - 5 мл раствора СО глюкозы. Колбы с содержимым погружают на 10 мин в кипя-щую водяную баню, затем охлаждают до комнатной темпе-ратуры и содержимое переносят количественно в мерные колбы вместимостью 50 мл и доводят объем растворов водой до метки.

Измеряют оптическую плотность растворов при длине волны 540 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

В качестве раствора сравнения используют воду очищенную.

Содержание полисахаридов в препарате в процентах (X) вычисляют по формуле:

X =

D₁ ^. 50 ^. 50 ^. 0,0004 ^. 100

D₀ ^. m ^. 5

где D₁ - оптическая плотность испытуемого раствора при длине волны 540 нм;

D₀ - оптическая плотность раствора СО глюкозы при длине волны 540 нм;

m – масса навески препарата, в граммах.

Примечания. Приготовление 1% раствора кисло-ты пикриновой. 1 г кислоты пикриновой раство-ряют в воде очищенной в мерной колбе вмести-мостью 100 мл и доводят объем раствора водой очищенной до метки.

Приготовление 20% раствора безводного натрия карбоната. 20 г безводного натрия карбоната растворяют в воде очищенной в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят объем раствора водой очищенной до метки.

Приготовление раствора стандартного образца глюкозы. 0.1 г (точная навеска) глюкозы, высушенной до постоянной массы, растворяют в воде очищенной в мерной колбе вместимостью 250 мл, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. 1 мл раствора стандартного образца содержит 0.0004 г глюкозы. Хранить в холодильнике в течение 10 дней.

* При смешивании реактивов и испытуемого раствора
необходимо строго придерживаться порядка прибавления, указанного при количественном определении [111].

Метод 2. Около 5 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл воды очищенной, колбу присоединяют к обратному холодиль-нику и кипятят при перемешивании на водяной бане течение 1 часа, охлаждают. Экстракцию водой повторяют дважды в течение 30 мин в тех же условиях. Водные извлечения объединяют и фильтруют в мерную колбу вместимостью 250 мл через 3 слоя марли. Фильтр промывают водой очищенной и доводят объем раствора водой очищенной до метки.

25 мл полученного раствора помещают в центрифужную пробирку, прибавляют 75 мл спирта этилового 95%, переме-шивают, подогревают на водяной бане при температуре 60⁰С в течение 5 мин. Через 30 мин содержимое центрифугируют с частотой вращения 5000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость фильтруют под вакуумом через высушенный до постоянной массы стеклянный фильтр ПОР 16. Затем осадок количественно переносят на тот же фильтр и промывают 15 мл спирта этилового 95%. Фильтр с осадком высушивают при температуре 100-105⁰С до постоянной массы.

Содержание полисахаридов в пересчете на абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:

Х =

(m₂ - m₁) ^. 250 ^. 100 ^. 100

m ^. 25 ^. (100 - W)

где m₁ - масса фильтра, в граммах;

m₂ - масса фильтра с осадком, в граммах;

m - масса навески сырья, в граммах;

W - потеря в массе при высушивании сырья, в процентах [7].

Метод 3. Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в круглодонную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл воды очищенной и нагревают с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 2 часов. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объем раствора водой очищенной до метки.

15 мл полученного извлечения переносят в центрифужную пробирку, прибавляют 45 мл спирта этилового 95%, перемешивают, подогревают на водяной бане при температуре 70⁰С в течение 5 мин.

Через 1 час содержимое пробирки центрифугируют с частотой вращения 3000 об/мин в течение 10 минут. Надосадочную жидкость отделяют, осадок количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл водой очищенной при нагревании, доводя объем до метки водой очищенной.

К 1 мл полученного раствора прибавляют 2 мл 0.2% раствора антрона в кислоте серной концентрированной, охлаждают при температуре 10-15⁰С в течение 5 минут, затем нагревают на кипящей водяной бане 15 минут и снова охлаждают до 10-15⁰С.

Измеряют оптическую плотность полученного раствора при длине волны 625 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

В качестве раствора сравнения используют смесь 1 мл воды очищенной и 2 мл 0.2% раствора антрона в кислоте серной концентрированной, выдержанную в тех же условиях, что и анализируемый раствор.

Содержание полисахаридов в процентах (Х) в пересчете на абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:

X =

С ^. 50 ^. 25 ^. 100 ^. 100

m ^. 10^{6 .} 5 ^. (100 - W)

где С – количество глюкозы, определенное по калибровочному графику, мкг/мл;

m – масса навески сырья, в граммах;

10⁶ – пересчет микрограммов в граммы;

W – потеря в массе при высушивании сырья, в процентах.

Примечания. Приготовление 0.2% раствора антрона. 0.05 г антрона (точная навеска) помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем кислотой серной концентрированной до метки. Срок годности раствора 1 сутки.

Построение калибровочного графика по растворам глюкозы. 0.14 г (точная навеска) глюкозы, высушенной до постоянной массы при температуре 100-105⁰С, растворяют в мерной колбе вместимостью 100 мл в воде очищенной и доводят объем до метки водой очищенной.

1 мл полученного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем водой очищенной до метки. 1 мл полученного раствора содержит 0.000056 г глюкозы (56 мкг).

К 0.8 мл раствора прибавляют 0.2 мл воды очищенной, полученный раствор содержит 44.8 мкг глюкозы. К 0.6 мл раствора прибавляют 0.4 мл воды очищенной, полученный раствор содержит 33.6 мкг глюкозы и т.д.

Определение моно- и олигосахаридов проводят титриметрическим методом раствором Фелинга в присутствии метиленового синего до появления красного окрашивания или спектрофотометрическим методом особенно для жидких лекарственных форм и сиропов.

Например, 1 г сиропа (точная навеска) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 10 мл воды очищенной, перемешивают, доводят объем водой очищенной до метки. [При необходимости 1 мл этого раствора разводят водой очищенной до 100 мл].

В качестве раствора сравнения используют раствор: 0.01 г сахарозы растворяют в мерной колбе на 250 мл водой очищенной. К 1 мл полученного раствора прибавляют 1 мл раствора фенола (50 г/л) и 5 мл кислоты серной концентрированной.

Берут 3 одинаковые пробирки (1 – испытуемый раствор, 2 – раствор сравнения, 3 – контрольная проба) помещают в кипящую водяную баню на 15 мин, охлаждают и через 20 мин измеряют оптическую плотность раствора при длине волны 435±2 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм по сравнению с контролем.

Количество сахарозы в процентах (Х) вычисляют по формуле:

X =

D ^. 0.01 ^. 100 ^. 100 ^. 125

D₀ ^. 1 ^. 1 ^. 250

где D - оптическая плотность испытуемого раствора при длине волны 435±2 нм;

D₀– оптическая плотность стандартного раствора при длине волны 435±2 нм;

0.01 – масса навески СО сахарозы.

В экстракте алтейного корня [112] определяют сумму восстанавливающих сахаров весовым или спектрофотометри-ческим методом.

Метод 1. Около 0.6 г препарата (точная навеска) помещают в круглодонную колбу со шлифом вместимостью 50 мл, прибавляют 10 мл воды очищенной и перемешивают в течение 5 мин. К полученному раствору прибавляют 20 мл спирта этилового 95%, колбу подсоединяют к обратному холодильнику и выдерживают на водяной бане при температуре 80±2⁰С в течение 10 мин; выпадает волокнистый осадок серо-коричневого цвета (полисахариды).

Колбу с осадком охлаждают под струей воды, выдерживают 30 мин при комнатной температуре и фильтруют количественно под вакуумом через стеклянный фильтр ПОР 16 диаметром 40 мм. Осадок на фильтре и колбе промывают 15 мл спирта этилового 95% порциями по 3 мл, высушивают под вакуумом в течение 5 мин, затем растворяют в 10 мл кислоты хлороводородной 10% порциями по 1-2 мл. Фильтрацию ведут при слабом разряжении, собирая фильтрат в ту же колбу, где осаждали полисахариды. Полученный раствор кипятят с обратным холодильником в течение часа, охлаждают и количественно переносят в стакан вместимостью 50 мл четырьмя миллилитрами 30% раствора натрия гидроксида порциями по 1 мл, сливая в стакан к основному раствору. Полученный раствор нейтрализуют потенциометрически до рН 6.5-7.0 30% раствором натрия гидроксида и 10% раствором кислоты хлороводородной и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл небольшими порциями воды очищенной, доводят объем до метки водой очищенной, пере-мешивают и фильтруют через складчатый фильтр (раствор А).

К 10 мл раствора А прибавляют 5 мл реактива Фелинга и нагревают на кипящей водяной бане в течение 5 мин; появляется красно-коричневый осадок (восстанавливающие моносахара). Осадок высушивают до постоянного веса, взвешивают.

Метод 2. В плоскодонную колбу вместимостью 50 мл помещают 1 мл 1% раствора кислоты пикриновой, 3 мл 20% раствора натрия карбоната и 1 мл раствора А. Колбу с содержимым погружают в кипящую водяную баню на 10 мин, охлаждают до комнатной температуры, содержимое количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора водой очищенной до метки.

Измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектро­фотометре при длине волны 460 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

В качестве раствора сравнения используют смесь, состоящую из 1 мл 1% раствора кислоты пикриновой, 3 мл 20% раствора натрия карбоната и 1 мл воды очищенной, которую нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 мин, охлаж-дают, и доводят объем раствора водой очищенной до 25 мл.

Параллельно измеряют оптическую плотность раствора, содержащего 1 мл СО глюкозы, приготовленного аналогично испытуемому раствору, начиная со слов "В плоскодонную колбу вместимостью 50 мл помещают 1 мл 1 % раствора кислоты пикриновой...".

Содержание суммы восстанавливающих сахаров, в пересчете на глюкозу и сухое вещество в процентах (X), рассчитывают по формуле:

X =

D ^. m₀ ^. 25 ^. 10 ^. 1 ^. 100 ^. 100

D₀ ^. m ^. 1 ^. 100 ^. 25 ^. (100 - W)

где D - оптическая плотность испытуемого раствора при длине волны 460 нм;

D₀ - оптическая плотность стандартного образца глюкозы при длине волны 460 нм;

m - масса навески СО глюкозы, в граммах;

m₀ - масса навески препарата, в граммах;

W - потеря в массе при высушивании сырья, в процентах.

Примечания. Приготовление раствора стандарт-ного образца глюкозы. Около 0.1400 г (точная навеска) высушенной до постоянной массы глюкозы помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора водой очищенной до метки, перемешивают. 10 мл полученного раствора перено-сят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора водой очищенной до метки, перемешивают. Хранить при комнатной температуре в течение 10 дней.

Приготовление 1% раствора кислоты пикри-новой. 1 г кислоты пикриновой растворяют в 60 мл горячей воды очищенной, охлаждают, переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой очищенной до метки, перемешивают. Сохраняют в склянках с притертой пробкой в защищенном от света месте, в течение месяца.

Приготовление 20% раствора натрия карбо-ната. 20 г натрия карбоната безводного растворяют в воде очищенной в мерной колбе вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой очищенной до метки, перемешивают. Срок годности 1 месяц.

Аналогичным представляется метод определения восстанав-ливающих сахаров спектрофотометрическим методом при разных длинах волн и метод титрования [113].

Метод 3. Около 0.05 г (точная навеска) пре­парата помещают в ампулу, прибавляют 2.5 мл кислоты хлороводород­ной разведенной, ампулу запаивают и нагревают при температуре 100-105⁰С в течение 3 ч. После чего содержимое ампулы при помощи 3 мл воды очищенной количественно переносят в стакан, помещают в стакан кусочек бу­маги конго, нейтрализуют сначала 30% раствором натрия гидроксида до покраснения бумаги, затем кислотой хлороводородной разведенной до посинения бумаги и 10% раствором натрия гидроксида до покраснения бумаги.

Раствор фильтруют через бумажный фильтр "синяя лента", переносят количественно при помощи 5 мл раствора в градуированную пробирку вме­стимостью 10 мл и доводят объем раствора водой до метки (раствор А).

В колбу вместимостью 50 мл помещают 1 мл 1% раствора кислоты пикриновой, 3 мл 20% раствора натрия карбоната и 1 мл раствора А. Колбу с содержимым погружают в кипящую водяную баню на 10 мин, затем охлаждают до комнатной температуры. Содержимое количественно, при помощи 15 мл воды очищенной, переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, до­водят объем раствора водой до метки и измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 460 нм, в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя в качестве раствора сравне­ния раствор, содержащий 1 мл 1% раствора кислоты пикриновой, 3 мл 20% раствора натрия карбоната и 1 мл воды очищенной, обработанный аналогично испытуемому раствору.

Параллельно измеряют оптическую плотность раствора, содержаще­го 1 мл раствора СО глюкозы, обра­ботанного аналогично испытуемому раствору, начиная со слов: "В колбу вместимостью 50 мл помещают 1 мл 1% раствора кислоты пикриновой..".

Содержание восстанавливающих сахаров (X) в препарате в пересчете на глюкозу и сухое вещество, в процентах, вычисляют по формуле:

X =

D ^. m₀ ^. 10 ^. 25 ^. 10 ^. 1 ^. 100 ^. 100

D₀ ^. m ^. 1 ^. 100 ^. 25 ^. 25 ^. (100 - W)

где D - оптическая плотность испытуемого раствора при длине волны 460 нм;

D₀ - оптическая плотность глюкозы при длине волны 460 нм;

m - масса навески СО глюкозы, в граммах;

m₀ - масса навески препарата, в граммах;

W - потеря в массе при высушивании сырья, в процентах.

Метод 4. Около 1 г (точная навеска) препарата помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 20 мл кислоты хлороводородной разведенной и 20 мл воды очищенной, нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин, охлаждают, доводят объем водой очищенной до метки и перемешивают (испытуемый раствор).

20 мл раствора Бенедикта помещают в мерную колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 40 мл воды очищенной, нагревают до кипения при перемешивании. Титруют испытуемым раствором до желтовато-зеленого цвета.

Содержание углеводов (X), в процентах вычисляют по формуле:

X =

F ^. 100 ^. 100

m ^. V

где F – фактор D-глюкозы;

m – масса навески препаратах, в граммах;

V – объем испытуемого раствора, израсходованный на титрование, в миллилитрах.

Примечания. Приготовление раствора Бенедикта. 100 г натрия карбоната растворяют в 600 мл воды очищенной, нагревая на водяной бане, прибавляют 200 г натрия-калия тартрата и 125 г калия роданида. Необходимо добиться полного растворения и полученный раствор фильтруют (раствор 1). 18.0 г меди сульфата растворяют в 100 мл воды очищенной, нагревая на водяной бане, фильтруют (раствор 2). Смешивают раствор 1 и раствор 2 в мерной колбе вместимостью 1 л, прибавляют 5 мл 5% раствора натрия ферроцианида, доводят объем
раствора водой очищенной до метки, перемешивают. Приготовленный раствор оставляют на ночь.

Стандартизация раствора Бенедикта. 1.2 г D-глюкозы (точная навеска) помещают в мерную колбу вместимостью 250 мл, растворяют в 20 мл кислоты хлороводородной разведенной, прибавляют 50 мл воды очищенной, нагревают до кипения на водяной бане и выдерживают еще в течение 30 мин. Охлаждают, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. 20 мл раствора Бенедикта помещают в мерную колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 40 мл воды очищенной, нагревают до кипения при перемеши-вании. Титруют раствором D-глюкозы в течение 2 мин до точки эквивалентности, при которой раствор должен быть бесцветным.

Коэффициент D-глюкозы =

m ^. 4 ^. 4.75 ^. V

5.01 ^. 1000

где m – масса навески D-глюкозы, в граммах; V - объем раствора D-глюкозы, израсходованный на титрование в миллилитрах.

Приготовление кислоты хлороводородной разведенной. 20 мл кислоты хлороводородной концентрированной разбавляют водой очищенной до объема 100 мл.

Содержание фруктозанов в препарате удобно определять по методу 5: 5 мл препарата помещают в пробирку для центрифугирования, прибавляют 25 мл спирта этилового 96%, перемешивают, на­гревают на водяной бане при температуре 30⁰С в течение 5 мин, оставляют на 1 ч, затем центрифугируют со скоростью вращения 5000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость фильтруют под вакуумом через стеклянный фильтр ПОР 16, осадок количественно переносят на тот же фильтр и последовательно промывают 15 мл спирта этилового 96%, 10 мл ацетона и 10 мл этилацетата. Осадок на фильтре растворяют в 10 мл горячей воды очищенной при перемешивании, раствор фильтруют под вакуумом. Фильтр промывают еще два раза горячей водой очищенной порциями по 10 мл, фильт­руют в тех же условиях, фильтраты объединяют. Раствор охлаждают до ком­натной температуры, количественно переносят при помощи 10 мл воды очищенной в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой очищенной до метки, перемешивают (раствор А).