Определение оптической плотности растворов с помощью фотоэлектроколориметра

Цель работы. Изучить взаимодействие света с веществом, которое связано с законами поглощения и рассеивания света; фотобиологические процессы и спектры фотобиологического действия. Научить студентов с помощью фотоколориметра определять оптическую плотность растворов.

Актуальность. Способность молекул поглощать свет лежит в основе спектрофотометрии, используемой в биологии и медицине для качественного анализа исследуемых систем; количественного определения веществ; изучения физико-химического состояния биомолекул; определения площади эффективного сечения биомолекул, знание которой часто требуется для расчетов квантовых выходов фотобиологических процессов.

Зная квантовый выход, можно получить информацию о структуре и функции биологических систем различной сложности: от мембран до целых органов и организмов и лекарственных препаратов. Высоким квантовым выходом обладают белки, флавины, витамины А и В₂, другие лекарственные вещества.

Спектры фотобиологического действия позволяют не только выяснить, какая область спектра наиболее эффективно вызывает данный фотобиологический процесс, но и какое вещество является акцептором квантов света в данном биологическом процессе.

Приборы и принадлежности: фотоэлектроколориметр (ФЭК), две кюветы, растворы рибофлавина с концентрациями: 0,75; 1,5; 3; 6.

Теоретическая часть

Закон Бугера.Одним из законов поглощения света является закон, полученный Бугером.

Пусть свет проходит через слой вещества толщиной d, интенсивность света на входе вещества I₀, на выходе - I_d (рис.1). Возьмем произвольно слой толщиной dx. Ослабление интенсивности света в этом слое обозначим через dI, величина которого зависит от толщины слоя d и интенсивности света I, падающего на этот слой:

,

где k – натуральный показатель поглощения, величина которого зависит от поглощающей среды, и длины световой волны и не зависит (в определенных пределах) от интенсивности света.

Знак «-» показывает на уменьшение интенсивности при прохождении света через вещество.

Для получения закона Бугера решаем составленное дифференциальное уравнение.

Делим обе части на I:

.

Интегрируем обе части и подставляем пределы интегрирования:

;

;

.

Подводим левую часть под общий логарифм:

.

Потенцируем:

.

Отсюда:

.

Графически закон Бугера представляет собой экспоненту (рис.2)

С учетом зависимости величины k от длины световой волны l формула закона Бугера примет вид:

,

где k_λ – монохроматический показатель поглощения света.

Закон Бугера-Ламберта- Бера.Для вывода закона Бугера-Ламберта-Бера введем понятие эффективного сечения поглощения молекулы s.

Эффективным сечением поглощения молекулы называется некоторая площадь вокруг молекулы. При попадании в нее фотона происходит его захват молекулой, т.е. произойдет поглощение.

Пусть свет интенсивностью I₀ падает перпендикулярно к боковой поверхности прямоугольного параллелепипеда с площадью S (рис. 3). На выходе слоя толщиной d интенсивность I_d. В прямоугольном параллелепипеде выделим слой толщиной dx, объем данного слоя будет равен S· dx. Концентрацию молекул в объеме параллелепипеда обозначим через n, тогда количество молекул в слое dx будет равно n·S·dx. Общая площадь эффективного сечения молекул этого слоя будет равна s·n·S·dx, т.е. если фотон попадает в эту площадь, то он будет захвачен молекулой, произойдет процесс поглощения.

Следовательно, вероятность взаимодействия одного фотона с молекулами выделенного слоя будет равна:

.

То есть, изменение интенсивности dI по отношению к интенсивности света I, падающего на слой толщиной dx, будет пропорционально вероятности, что процесс поглощения произошел

.

Проинтегрируем обе части равенства:

.

.

Потенцируем:

.

Отсюда:

.

Предположим, что молекулы поглощающего вещества находятся в растворителе, который не поглощает свет .

Молярная концентрация

,

где N_A – число Авагадро.

Следовательно, .

Тогда произведение

где - натуральный молярный показатель поглощения, равный , т.е. это есть суммарное эффективное сечение поглощения всех молекул одного моля растворенного вещества (физический смысл ).

С учетом закон Бугера-Ламберта-Бера принимает следующий вид:

.

На практике закон Бугера-Ламберта-Бера применяют в следующем виде:

,

где – молярный показатель поглощения:

.

Для устранения зависимости от длины световой волны l вводится монохроматический молярный показатель поглощения _, тогда:

.

Коэффициент пропускания и оптическая плотность растворов. Отношение интенсивности света на выходе вещества I_d к интенсивности на входе I₀ называется коэффициентом пропускания t::

.

Десятичный логарифм величины, обратной коэффициенту пропускания, называется оптической плотностью раствора Д:

.

На основании закона Бугера-Ламберта-Бера разработаны методы по определению концентрации веществ в окрашенных растворах (концентрационная колориметрия).

Зависимости называются спектрами поглощения вещества. Они являются источниками информации о состоянии вещества и о структуре энергетических уровней атомов и молекул.

Рассеяние света.Процесс рассеяния света заключается в отклонении по всем направлениям светового пучка, проходящего через оптически неоднородную среду.

Под оптически неоднородной средой подразумевается прозрачная для света среда с вкраплением областей, обладающих иным показателем преломления по сравнению со средой. Различают три типа неоднородностей: мелкие,ая работаны методы по определению концентрации веществ в окращенных растворах (концентрационю раствора еский определнных предел средние, крупные.

Рэлей установил, что в случае мелких неоднородностей (дым, туман, взвеси, эмульсии), а также при молекулярном рассеянии интенсивность рассеянного света обратно пропорциональна четвертой степени длины световой волны l (закон Рэлея):

.

Для среднедисперсной среды:

.

Для крупнодисперсной среды:

.

Уменьшение интенсивности света в результате рассеяния, как и при поглощении, описывают показательной функцией:

,

где m – натуральный показатель рассеяния.

Процессы поглощения и рассеяния света идут одновременно. С учетом обоих процессов уменьшение интенсивности света определяется следующей функцией:

.

Фотобиологические процессы.К фотобиологическим относятся процессы, начинающиеся с поглощения света одним из биообъектов и заканчивающиеся определенной физиологической реакцией организма. Различают негативные и позитивные фотобиологические процессы.

Негативные фотобиологические эффекты в организма человека и животных бывают двух типов:

1. Фототоксический эффект вызывает повреждение кожи или глаз, не сопровождающиеся аллергическими реакциями, проявляющимися в форме эритемы, эдемы, пигментации, помутнения хрусталика и т.д.

2. Фотоаллергический эффект включает в себя первичный иммунологический механизм.

К позитивным фотобиологическим эффектам относятся:

1. Зрение.
2. Фотопериодизм – это регуляция суточных и годовых циклов жизни человека путем циклических воздействий свет - темнота. Процесс идет под действием видимого света. Фотопериодическим рецептором у человека являются глаза.
3. Образования витамина Д из провитаминов под действием ультрафиолета.

Фотобиологические процессы можно разбить на ряд стадий:

1. Поглощение кванта света.

2. Внутримолекулярные процессы размена энергии.

3. Межмолекулярный перенос энергии возбужденного состояния.

4. Первичный фотохимический акт.

5. Темновые превращения первичных фотохимических продуктов, заканчивающиеся образованием стабильных продуктов.

6. Биохимические реакции с участием фотопродуктов.

7. Общефизиологический ответ на действие света.

Биофизика занимается изучением только первых четырех процессов и частично темновых процессов, непосредственно следующих за первичным фотохимическим актом.

Спектры фотобиологического действия.Спектром фотобиологического действия называется зависимость фотобиологического эффекта от длины волны действующего света.

Рассмотрим один из типов спектра фотобиологического действия. Пусть на кювету падает свет интенсивностью I₀, на выходе кюветы интенсивность света I. Толщину кюветы обозначим через l. В кювете находится разбавленный раствор фермента с концентрацией n.

В результате процесса поглощения концентрация n фермента в растворе будет уменьшаться, следовательно, запишем равенство:

где - поперечное сечение поглощения фермента;

- скорость изменения концентрации фермента;

- квантовый выход фотохимической реакции;

знак «-» показывает на уменьшение концентрации со временем.

Решаем дифференциальное уравнение I-го порядка с разделяющимися переменными:

;

где n₀- начальная концентрация фермента в растворе (в момент времени t=0),

n_t - концентрация в момент времени t.

.

Или

.

Произведения I₀ на время t: - доза облучения, , s_х - эффективное сечение молекулы для фотохимического превращения.

Подставим эти параметры (Д и s) в полученное выше уравнение и получим:

.

Для определения s_х строят график зависимости величина s_х определяет наклон прямой (рис.5).

Рис. 4. Дозовая зависимость инактивации фермента.

При воздействии на бактерии ультрафиолетом было установлено, что кривая гибели бактерий имеет максимум в области 265 нм, а также, что форма этой кривой очень напоминает спектр поглощения нуклеиновых кислот. Поэтому был сделан вывод, что гибель бактерий под действием ультрафиолета связана с повреждением нуклеиновых кислот.

Оптическая схема ФЭК

1 – осветитель; 2 – конденсор (дает изображение нити накала осветителя в плоскости диафрагмы); 3 – диафрагма; 4 – объектив; 5 – светофильтр (монохроматор); 6 – кювета; 7 – пластина, делящая световой поток на два: 10% светового потока направляется на фотодиод (8), а 90% - на фотоэлемент (9).

Порядок выполнения работы