Правила резания на микротоме
Предпосылкой для получения хороших гистологических срезов служит правильный выбор угла наклона ножа и угла резания.
Под углом наклона понимают угол, образуемой нижней поверхностью ножа с плоскостью резания. Наилучший считается такой угол наклона, при котором плоскость заточки ножа расположена параллельно верхней поверхности блока. Обычно он равен . Если нож установлен так, что угол наклона больше оптимального, то срез будет крошиться, если меньше – резка невозможна, так как лезвие ножа будет лишь скользить по поверхности блока.
Под углом резания подразумевают угол между длинной осью ножа и воображаемой линией, идущей через центр блока параллельно движению салазок, несущих нож. Величина угла резания зависит от свойств обрабатываемого материала: чем он мягче, тем угол меньше, и, наоборот, чем тверже, тем угол больше. При косом расположении ножа уменьшается сопротивление его режущего края поверхности блока, что облегчает резку мягких блоков.
Резание на микротоме
Для того чтобы срез можно было исследовать в микроскоп, необходимо, чтобы структурные компоненты составляющих его тканей были хорошо различимы в проходящем свете и чтобы срез был защищен от возможного загрязнения и повреждения. Поэтому дальнейшая обработка среза предусматривает его окрашивание, просветление и заключение.
Блок подвергают обрезке, удаляя свободный чистый парафин (т. е. расположенный вне ткани). С боковых сторон блока оставляют лишь в виде площадки с материалом. Если не произвести такого удаления парафина, то срезы будут не гладкими, а морщинистыми (выпуклыми) в середине по той причине, что чистый парафин, остающийся с боков, сокращается во время резки в большей степени по сравнению с парафином, пропитывающим ткань.
Неприятный момент сморщивания срезов можно уменьшить, подвергая блок охлаждению (лед), Т. е. сообщая ему большую твердость.
Подготавливая парафиновый блок к резке при необходимости получения лент надо стремиться придавать ему правильную прямоугольную форму. Парафиновый блок прочно закрепляют в зажиме микротома, расположив параллельно длиннику микротома. Затем, установив необходимый угол резания и правильный угол наклона ножа, его прочно закрепляют винтами зажимами и располагают под блоком. При строго поперечном положение ножа очень плотный объект заставляет вибрировать его, что сопровождается характерным скрипом и образованием поперечных полос на поверхности блока.
После этого, регулируя винтами механизм подачи, блок устанавливают таким образом, чтобы верхняя его плоскость находилась до лезвия ножа на 0,5-1 мм. Когда предварительная подгонка блока к ножу закончена, устанавливают микрометрическую шкалу на получение толстых (25-30 мкм) срезов и движением ножевых салазок начинают подавать блок вверх до получения с него первых полных срезов. Затем производят моделирование блока: срезают скальпелем избыточный парафин, оставляя вокруг залитого объекта слой не более 2-3 мм, и придают блоку прямоугольную форму. После этого устанавливают микрометрическую шкалу на нужную толщину среза и приступают к окончательной резке материала.
Следует помнить, что перемещение ножевых салазок вдоль рельсового пути нужно производить плавно, без излишних усилий. Нельзя надавливать на рукоятку сверху, так как это проводит к вытеснению слоя масла, находящегося между скользящими поверхностями, и опусканию ножа, вследствие чего срезы получаются неравномерными. Движение микротомным ножом в момент прохождения над блоком надо производить быстро.
Правильно залитые небольшие кусочки органов и тканей при оптимальном температурном режиме в помещении режутся хорошо, и срез, как правило, ложится на нож в расправленном состоянии (угол резания прямой). При резке больших блоков и твердого материала срезы часто закручиваются. Однако этого можно избежать путем придерживания и приподнимания среза кисточкой за передний его край в процессе резки. Против закручивания срезов помогает и уменьшение их толщины. При косом положении ножа срезы будут одиночными, но зато резка идет резка легче и срезы получаются более тонкими.
Так как парафин сильно тупит ножи, то для резки парафиновых блоков лучше применять ножи твердой закалки, с толстым клином.
Толщина парафиновых срезов колеблется от 3-5 до 15 мкм и зависит как от качества заливки материала, так и от ножа.
Нужно следить, чтобы срез не был прижат к ножу, так как при этом, происходит его приклеивание и повреждение. Готовый срез осторожно снимают с ножа влажной кисточкой (в направлении от спинки к лезвию) и переносят в чашку с теплой (350-400С) водой. Помещают срезы на воду обязательно поверхностью, прилежащей к ножу, определить которую можно по характерному блеску (верхняя сторона всегда матовая).
При резке надо следить, чтобы волоски от кисточки не попадали под режущий край ножа, так как это приводит к повреждению лезвия.
Для наклеивания расправленные срезы вылавливают из воды на заранее подготовленное предметное стекло; для этого стекло одним концом опускают в чашку с водой, проводят под срез и подхватывают его, удерживая препаровальной иглой на средней части стекла. Остатки воды вокруг среза тщательно удаляют тряпочкой и проглаживают пальцем через 2-3 слоя сухой и теплой тряпочкой.
Так как парафиновые срезы при наклейке вбирают воду, то во избежание недоразумений при дальнейшей обработке (т. е. окраске) необходимо их тщательно просушить, только после этого приступить к окраске.
Недостаточно высушенные срезы легко отклеиваются во время окраски, а главное, плохо освобождаются от парафина при обработке ксилолом. Критерием хорошо высушенных срезов являются приобретением ими большей прозрачности по сравнению с беловатыми плохо просушенными срезами.
Если приходится торопиться с окраской, то рекомендуется свежеприклеенные и немного подсохшие (в термостате или на воздухе) срезы слегка подогреветь на платформе электроплиты, осторожно доводя парафин до признаков начального оплавления, но не полного расплавления. Такая обработка способствует более прочной фиксации срезов на предметном стекле.
Для того чтобы срезы прочно пристали к предметному стеклу и не отклеились во время окраски, стекла специально обрабатывают с целью обезжиривания. Для этого их основательно моют в горячей мыльной воде или длительно кипятят в 2-3 % содовом растворе, затем хорошо ополаскивают в чистой горячей воде и промывают (несколько часов) в проточной.
Обработанные и промытые в воде предметные стекла протирают льняной тряпкой, держа стекла за края; и хранят в 960 спирте или в смеси спирта эфиром, откуда их по мере надобности вынимают пинцетом и высушивают. На хорошо обезжиренном предметном стекле вода должна растекаться тонким слоем, а не собираться в капли.
Хорошие предметные стекла должны быть из белого стекла и иметь совершенно ровную поверхность, толщина их не должна превышать 1,2 мм.
Перед самой наклейкой срезов высушенные стекла покрывают тонким слоем смеси белка с глицерином.
Приготовление белка с глицерином. Берут свежий яичный белок (без примеси желтка), взбивают вилкой или шпателем до состояния пены и выливают на большой широкопористый фильтр, предварительно смоченный дистиллированной водой. Фильтрация продолжается около 24 часов. К профильтрованному белку прибавляют равный объем глицерина, размешивают и добавляют кусочек тимола для предупреждения загнивания.
Приготовление предметного стекла с белком. На сухое предметное стекло стеклянной палочкой наносят маленькую капельку смеси белка с глицерином и пальцем тщательно размазывают тонким слоем. Руки должны быть предварительно вымыты, а палец, которым производят размазывание смеси, обработан спиртом. Нанесенный на стекло слой белка с глицерином свертывают при небольшом нагревании (50-600) для чего стекло проводят 2-3 раза над горячей электроплиткой. После такой обработки предметное стекло считается готовым и на него можно наклеивать срезы.
Возможные погрешности при изготовлении парафиновых срезов
Для того чтобы получить хорошие гистологические срезы, необходимо уметь своевременно распознать и устранить причину, ухудшающую качество срезов.
а) Срез крошится.
Причины:
1) твердый парафин
2) низкая температура окружающей среды
3) медленное охлаждение парафина при заливке
4) большой угол наклона ножа
Устранение:
1) залить материал в более мягкий парафин после предварительного растапливания блока в термостате
2) дышать на поверхность блока (согревание) перед каждым движением ножа или приспособить эл. плиту рядом с микротомом
3) изменить угол наклона ножа.
б) Залитый материал в процессе резки выпадает из окружающей массы парафина.
Причины:
1) при переносе кусочка в формочку для заливки произошло его охлаждение.
Устранение:
1) необходимо блок растопить в термостате и залить заново, строго соблюдая правила заливки, после предварительного растапливания материал переносят в промежуточные срезы (для удаления спирта), затем вновь пропитывают и заливают
2) заливка произведена охлажденным парафином
3) недостаточное удаление спирта перед пропитыванием.
в) Плоскость среза неровная, материал плохо режется или совсем не режется, нож подскакивает над поверхностью блока.
Причина:
1) переутомление материала при проводке и фиксации.
Устранение:
Невозможно. Можно лишь несколько размягчить материал, если на поверхность резания перед каждым движением ножа наносить слой горячего парафина кисточкой (дав ему затем остыть) или дышать на поверхность блока.
г) Срезы закручиваются, прилипают к поверхности ножа, мнутся.
Причины:
1) малый угол наклона ножа
2) мягкий парафин
3) высокая температура окружающей среды.
Устранение:
1) изменить угол наклона
2) залить материал в более твердый парафин и охладить блок путем помещения перед резкой в холодильник (можно также положить на поверхность резание кусочек льда)
3) приклеивание, сморщивание или разрыв срезов, особенно при резке органов, богатых костной, хрящевой или плотной соединительной ткани, могут быть следствием их электризации.
Устранение:
помещать на лезвие (в месте прохождения среза) каплю воды, дышать на лезвие и блок, натирать участок лезвия и прилежащую часть ножа куском твердого парафина.
е) Срезы разрываются или покрыты бороздами.
Причины:
1) зазубрины на лезвии ножа
2) грязный парафин (плотные соринки царапают срез и портят лезвие);
3) материал плохо декальцинирован.
Устранение:
1) точка и правка ножа или перемещение в ножедержателе
2) перезаливка в чистый парафин
3) устранить нельзя.
ж) Плоскость среза не однородна (беловатая в средней части).
Причина:
Недостаточное обезвоживание.
Устранение:
Расплавление блока и проведение материала через промежуточные срезы до абсолютного спирта. После обезвоживания проводят через промежуточную среду, пропитывают и заливают.