САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ. I. Изучение микрофлоры кожи.а) Исследование смывов с поверхности кожи рук
I. Изучение микрофлоры кожи.а) Исследование смывов с поверхности кожи рук. Стерильным тампоном, смоченным в среде Кесслера (пептонная вода с лактозой, желчью и генциан-виолетом), делают смывы с обеих рук, протирая ладони, межпальцевые промежутки и подногтевые пространства, тампон помещают в среду Кесслера, инкубируют в термостате при 370 С 24 часа. б) посевы-отпечатки пальцев на сектора чашки со средой Левина. Учет результатов посевов будет выполнен на следующем занятии.
2. Изучение микрофлоры полости рта. Приготовление мазка из зубного налета. Окраска по Граму или по Бурри. Препарат промикроскопировать и зарисовать.
3. Исследование микрофлоры зева. Произвести отбор материала из зева с помощью тампона, приготовить мазок, окрасить по Граму, промикроскопировать. Микрокартину зарисовать.
4. Изучение микрофлоры кишечника (демонстрация). Из исследуемых фекалий готовят разведения 10 -2, 10-4, 10-6 и т.д. По 0,1 мл каждого разведения засевают на среды Эндо, кровяной, желточно-солевой агар, среды Сабуро, Блаурокка (печеночный агар с лактозой и цистином), другие питательные среды и инкубируют при 370 С. Подсчитывают число выросших колоний и определяют число КОЕ в 1 г материала. Проводят отсев 2—3 колоний каждого вида для выделения и идентификации чистых культур микроорганизмов по биохимическим свойствам. Содержание микрофлоры кишечника в колониеобразующих единицах (КОЕ) у здорового человека представлено в таблице 5. На основании учета демонстрационных посевов сделать выводы о состоянии микробиоценоза кишечника обследованного пациента.
5. Количественное определение чувствительности бактерий к антимикробным препаратам методом серийных разведении (демонстрация). Метод применяют для определения минимальной подавляющей концентрации (МПК) — наименьшей концентрации антибиотика, полностью подавляющей рост исследуемых бактерий. Для этого готовят основной раствор антибиотика, содержащий препарат в определенной концентрации (мкг/мл или ЕД/мл) в физиологическом, буферном растворе или в специальном растворителе. Основной раствор используют для приготовления 2-кратных серийных разведений антибиотика (от 1 до 128 ед/мл) в питательной среде — бульоне (в объеме 1 мл) или агаре. Из исследуемой бактериальной культуры готовят суспензию стандартной плотности и засевают по 0,1 мл на среды с разной концентрацией антибиотика, а также на среду без препарата (контроль культуры). Посевы инкубируют при 370 С в течение 20—24 ч или более (для медленно растущих бактерий), после чего отмечают результаты опыта по помутнению питательного бульона или появлению видимого роста бактерий на агаре, сравнивая с контролем. Наименьшая концентрация антибиотика, полностью подавляющая рост исследуемой культуры, принимается за МПК.
6. Микротест-системы для определения чувствительности к антимикробным препаратам (демонстрация) предназначены для быстрого определения клинической чувствительности бактерий к антибиотикам, которые в 2 стандартных концентрациях (средней терапевтической и
Таблица 5.
Содержание микрофлоры кишечника здорового человека в норме (КОЕ/грамм фекалий)
| Наименование представителей | КОЕ |
| Бифидобактерии | 108 - 1010 |
| Лактобактерии | 106 -109 |
| Бактероиды | 107 -109 |
| Пептококки и пептострептококки | 105 - 106 |
| Эшерихии | 106 -108 |
| Стафилококки (гемолитические, плазмокоагулирующие) | 103 |
| Стафилококки (негемолитические,. коагулазоотрицательные) | 104 -105 |
| Стрептококки | 105 - 107 |
| Клостридии | 103 - 105 |
| Эубактерии | 109 - 1010 |
| Дрожжеподобные грибы | 103 |
| Условно-патогенные энтеробактерии, неферментирующие грамотрицательные палочки | 103 |
максимальной) находятся в лунках пластиковых планшетов. Мерной бактериологической петли (объем 1 мкл) исследуемую чистую культуру вносят в 5 мл стандартной питательной среды, содержащей индикатор, приготовленную бактериальную суспензию разливают в лунки планшета по 0,1 мл и инкубируют при оптимальных для данного вида бактерий условиях температуры и газового состава среды. О росте бактерий судят по изменению цвета индикатора. Если бактерии сохраняют жизнеспособность в присутствии антибиотика, выделение продуктов метаболизма приводит к изменению цвета индикатора. Отсутствие изменения цвета свидетельствует о полном подавлении жизнедеятельности микроба. Результаты определяют через 4 ч инкубации с помощью спектрофотометра.
7. Определение клинической чувствительности бактерий к антимикробным препаратам методом дисков (диффузионный тест) - демонстрация.Метод основан на подавлении роста бактерий на плотной питательной среде под действием строго определенной концентрации антибиотика, содержащегося в стандартном бумажном диске. Препарат, диффундируя в агар создает вокруг диска градиент концентрации антибиотика с формированием зоны задержки роста, размер которой зависит от чувствительности бактерии и свойств антибиотика. Содержание препарата определяется исходя из терапевтических концентраций каждого антибиотика и средних значений минимальных подавляющих концентраций для патогенных бактерий. Исследуемую бактериальную культуру, суспендированную в физиологическом растворе, засевают газоном в чашки Петри на специальные питательные среды (Мюллера-Хинтон или АГВ, не препятствующих диффузии антимикробных веществ и не оказывающих на них отрицательного действия), на поверхность которых накладывают диски с антибиотиками. Посевы инкубируют 18—20 ч при 370 С. Учет результатов осуществляют путем измерения диаметра зоны полной задержки роста. Вывод о чувствительности бактерий к антибиотикам осуществляют с учетом специально разработанных критериев (таблица 6).
8. Количественное определение чувствительности бактерий к антимикробным препаратам с помощью Е-теста. Е-тест является вариантом диффузионного метода, позволяющим определять МПК антибиотика. Для этого вместо индикаторных дисков с антибиотиками используют особые полимерные полоски, содержащие иммобилизованные антимикробные препараты в виде непрерывного градиента концентраций от 0,016 до 256 мкг/мл. На другой стороне полоски Е-теста нанесена шкала значений МПК. При помещении полоски на поверхность агара регулируемый процесс диффузии обеспечивает создание в питательной среде вокруг полоски стабильного градиента концентрации препарата, соответствующего шкале. После инкубации посева вокруг полоски образуется зона задержки роста, имеющая форму эллипса. Значение МПК соответствует месту пересечения эллипсовидной зоны с полоской Е-теста. Для интерпретации результатов (оценки клинической чувствительности) используют стандартные критерии.
Таблица 6
Интерпретация значений диаметров зон задержки роста при определении чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам (среда АГВ)
| Противомикробные препараты в диске | Диаметр зон или культур в мм | ||
| Устойчивых | Промежуточных | Чувствительных | |
| Бензилпенициллин для стафилококков | <20 | 21-28 | >29 |
| Бензилпенициллин для др. бактерий | <10 | 11-16 | >17 |
| Ампициллин для стафилококков | <20 | 21-28 | >29 |
| Ампициллин для Грам (-) бактерий | <9 | 10-13 | >14 |
| Карбенициллин 2.5 мкг | <14 | 15-18 | >19 |
| Карбенициллин 100 мкг (для .aeruginosa) | <11 | 12-14 | >15 |
| Оксациллин 10 мкг | <15 | 16-19 | >19 |
| Оксациллин 1 мкг | <10 | 11-12 | >13 |
| Азлоциллин (для P.aeruginosa) | <13 | 14-16 | >17 |
| Цефалотин | <14 | 15-18 | >19 |
| Цефазолин | <14 | 15-18 | >19 |
| Цефуроксим | <14 | 15-18 | >19 |
| Цефокситин | <14 | 15-18 | >19 |
| Цефотаксим | <14 | 15-18 | >19 |
| Цефтриаксон | <14 | 15-18 | >19 |
| Цефоперазон | <14 | 15-18 | >19 |
| Цефтазидим | <14 | 15-18 | >19 |
| Цефалексин | <14 | 15-18 | >19 |
| Цефаклор | <14 | 15-18 | >19 |
| Цефиксим | <15 | 16-19 | >20 |
| Ванкомицин для энтерококков | <14 | 15-16 | >17 |
| Ванкомицин для стафилококков | <11 | - | >12 |
| Фузидин | <16 | 17-20 | >21 |
| Линкомицин | <19 | 20-23 | >24 |
| Клиндамицин | <14 | 15-20 | >21 |
| Олеандомицин | <12 | 13-17 | >18 |
| Эритромицин | <17 | 18-21 | >22 |
| Азитромицин | <13 | 14-17 | >18 |
| Тетрациклин | <16 | 17-21 | >22 |
| Доксициклин | <15 | 16-19 | >20 |
| Левомицетин | <15 | 16-18 | >19 |
| Рифампицин | <12 | 13-15 | >16 |
| Полимиксин | <11 | 12-14 | >15 |
| Стрептомицин | <16 | 17-19 | >20 |
| Канамицин | <14 | 15-18 | >19 |
| Неомицин | <12 | 13-16 | >17 |
| Гентамицин | <15 | - | >16 |
| Тобрамицин | <14 | - | >15 |
| Сизомицин | <15 | - | >16 |
| Амикацин | <14 | 15-16 | >17 |
| Нетилмицин | <12 | 13-14 | >15 |
| Фурадонин | <15 | 16-18 | >19 |
| Фурагин | <15 | 16-18 | >19 |
| Ципрофлоксацин | <15 | 16-20 | >21 |
| Азтреонам | <15 | 16-21 | >22 |
| Пиперациллин (для P.aeruginosa) | <17 | - | >18 |
| Офлоксацин | <12 | 13-16 | >17 |
| Рокситромицин | <14 | 15-18 | >19 |
| Кларитромицин | <13 | 14-17 | >18 |
| Цефамандол | <14 | 15-17 | >18 |
| Цефепим | <14 | 15-17 | >18 |
| Имипинем | <13 | 14-15 | >16 |
| Мероменем | <13 | 14-15 | >16 |
| Налидиксовая кислота | <12 | 13-17 | >18 |