САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ. 1. Постановка и учет реакции связывания комплемента (РСК)

1. Постановка и учет реакции связывания комплемента (РСК). Реакцию ставят в соответствии с таблицей 11. РСК протекает в две фазы. В первой фазе реакции участвуют антиген, антитело, комплемент. При соот­ветствии антигена антителу образуется комплекс, связывающий комплемент. При отсутствии соответствия антигена и анти­тела комплемент остается свободным. Вторая фаза реакции (ин­дикаторная) выявляет связывание комплемента и происходит меж­ду комплементом и реагентами гемолитической системы (смесь взвеси эритроцитов барана и гемолитической сыворотки). Если комп­лемент связан в первой фазе реакции, гемолиза эритроцитов под действием гемолизинов не происходит ( задержка гемолиза - реакция положитель­на); если комплемент свободен, наблюдается гемолиз (реакция отрицательна).

2. Постановка и учет реакции кольцепреципитации по Асколи.Реакция Асколи используется для выявления термостабильного анти­гена возбудителя сибирской язвы в материале (кожа, шерсть), подозрительном на загрязнение данными микробами. Техника постановки реакции: в преципитационную пробирку наливают цельную преципитирующую сибиреязвенную сыворотку в количестве 0,5 мл. Пастеровской пипеткой наслаивают по стенке пробирки 0,5 мл исследуемого антигена. Антиген готовят путем кипячения ма­териала в растворе кислоты. В контрольную пробирку добавляют вместо антигена физиологический раствор. В случае положительного результата на границе антигена и сыворотки обра­зуется преципитат в виде кольца.

3. Учет реакции преципитации в геледля определения токсигенности дифтерийных бактерий (демонстрация). Чашку Петри заливают питательным агаром, на дно чашки накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной противодифтерийной анти­токсической сывороткой. Перпендикулярно полоске бумаги засевают исследуемую Таблица 11

Схема постановки реакции связывания комплемента

Компоненты реакции	Опыт	КПС	КОС	КС	КА	КК	КГС
Сыворотка больного 1:5, мл	0,5	-	-	0,5	-	-	-
Антиген в рабочем титре, мл	0,5	0,5	0,5	-	0,5	0,5	-
Комплемент в рабочей дозе, мл	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Положительная сыворотка, мл	-	0,5	-	-	-	-	-
Отрицательная сыворотка, мл	-	-	0,5	-	-	-	-
Физиологический раствор	-	-	-	0,5	0,5	0,5	1,0
Инкубация при 370 С в течение 30 минут
Гемолитическая система	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
Инкубация при при 370 С в течение 30 минут, учет результатов

Обозначения: КПС – контроль положительной сыворотки, КОС – контроль отрицательной сыворотки, КА- контроль антигена, КК – контроль комплемента, КГС – контроль гемолитической системы

Рис. 15. Реакция преципитации в геледля определения токсигенности дифтерийных бактерий

культуру. Посев инкубируют при 37°С в течение 24 часов. Выделяющийся при росте дифтерийной палочки токсин диффундирует в питательную среду и вступает в реакцию с антитоксическими антителами. В местах взаимодействия дифтерийного токсина с антителами формируется преципитат в виде беловатых линий

4. Иммуноэлектрофорез (демонстрация). С помощью иммуноэлектрофореза анализируют различные антигены микробов и вирусов, антитела, сыворотку крови человека, ликвор и т.д. Исследуемый материал вносят в лунку, расположенную в геле на стеклянной пластине и разделяют его фракции электро­форезом. Затем в лунку, вырезанную в геле параллельно линии электрофоретической миграции белков, вносят сыворотки против антигенов, которые хотят обнаружить (например, против антигенов менинго­кокка). Антитела сыворотки диффундируют в агар и в местах встречи с со­ответствующими антигенами образуют зоны преципитации в виде дуги.

5. Реакция нейтрализации токсина антитоксином при ботулизме (демонстрация). Реакцию ставят с фильтратом, полученным из консервов домашнего приготовления (например, из грибов), послуживших причиной отрав­ления больного. К фильтрату добавляют поливалентную противоботулиническую сыворотку в раз­ведении 1:40. Смесь выдерживают 2 часа при температуре 37⁰ С, вводят мыши внутрибрюшинно в объеме 0, 5 мл. Контроль­ной мыши вводят 0,5 мл фильтрата. Если токсин, содержащийся в фильтрате, соответствует сыворотке, то произой­дет нейтрализация токсина и мышь не погибнет. Контрольная мышь погибает с явлениями параличей.

6. Учет реакции Кумбса (демонстрация). Реакция Кумбса позволяет выявить неполные (одновалентные) антитела, которые при соединении с эритроцитами, бактериями и риккетсиями не дают видимых эффек­тов реакции антиген-антитело. Прибавление кроличьей сыворот­ки против глобулинов человека приводит к агглютинации, т.к. антитела этой сыворотки бивалентны и взаимодействуют с непол­ными антителами, связанными с бактериями или эритроцитами, с образованием осадка.

Реакция Кумбса при бруцеллезе ставится в тех случаях, ког­да титр классического варианта реакции агглютинации меньше диагностического ( 1:100). Добавление в пробирки с отрицательными результатами антиглобулиновой сыворотки приводит к увеличению титра антител. Это связано с тем, что неполные антитела появляются в крови больных в более ранние сроки и в более высоких титрах, чем полные.

7. Реакция флоккуляции (демонстрация). В результате взаимодействия ток­сина или анатоксина с антитоксической сывороткой выпадают хлопья флоккулята. Наиболее интенсивная и ранняя (иници­альная) флоккуляция происходит в пробирке, где антиген и антитело содержатся в эквивалентных соотношениях.

Реакцию ставят в два этапа. Сначала по стандартной сыво­ротке устанавливают пороговую величину флоккуляции Lf(Limes flocculationis) в 1 мл токсина. Lf токсина определяется его минимальным количеством, которое дает инициальную флоккуляцию с 1 международной единицей (ME) сыворотки. Затем известной силы токсин и испытуемую антитоксическую сыворотку разливают в пробирки в опреде­ленном объеме, выдер­живают в водяной бане при температуре 45 °С в течение 30 мин до выпадения хлопьев в одной из них.

Инициальная флоккуляция проявляется в той пробирке, где количество токсина соответствует количеству международных единиц сыворотки. Если флоккуляция произошла в 3-й пробирке, в 0,4 мл сыворотки находится 40 ME. Сле­довательно, 1 мл сыворотки содержит 40:0,4=100 ME.

8. Антистрептолизиновая реакция (демонстрация). Реакция основана на фе­номене нейтрализации гемолитического действия микроб­ного токсина (0-стрептолизина) антитоксическими антитела­ми иммунной сыворотки.

Для постановки реакции предварительно определяют мини­мальную гемолитическую дозу токсина (0-стрептолизина), т.е. наименьшее его количество, которое вызывает гемолиз 0,2 мл 5% взвеси эритроцитов кролика. Затем определяют рабочую дозу 0-стрептолизина, т.е. наибольшее количество токсина, которое в смеси с 1 АЕ (антитоксической единицы) стандарт­ной антитоксической сыворотки полностью нейтрализуется и не вызывает гемолиза эритроцитов. Для постановки основного опыта готовят разведения исследуемой сыворотки, к каждому из которых добавляют рабочую дозу токсина, инкубируют 45 мин при 37⁰ С, затем вносят равный объем взвеси эритроцитов и инкубируют 1 час при 37⁰ С и 18 часов при комнатной температуре. Обязательным является контроль на возможность спонтанного гемолиза эритроцитов. Положительная реакция характеризуется отсутствием гемолиза в результате нейтрализации стрептолизина (гемолизина) соответствующими антителами. Студенты производят учет демонстрационной реакции.

9. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА - демонстрация) основана на взаимодействии вирусных антигенов (гемагглютининов) со специфическими антителами, в результате чего происходит блокада (торможение) гемагглютинирующей активности вируса.

Развернутую РТГА ставят в лунках полистироловых плас­тин. Предварительно определяют титр вирусного антигена в реакции гемагглютинации для подбора рабочей дозы. В лунках готовят 2-кратные разведения исследуемой сыворотки, добавляют равный объем взвеси вируса в рабочем разведении и инкубируют 2 ч при температуре 37⁰ С. Затем добавляют 1 % взвеси куриных эритроцитов, инкубируют 2 ч и оценивают результат по феномену торможения гемагглютинации. Положительная РТГА характеризуется образованием плотного осадка эритро­цитов на дне лунки в виде диска или кольца с ровными краями. Титр антител определяют по последней лунке с положительной РТГА. Произвести учет демонстрационной РТГА.