Микробиологическое исследование. Холерные вибрионы очень чувствительны к дезинфицирующим веществам, поэтому в посуде, куда помещают исследуемый материал

Холерные вибрионы очень чувствительны к дезинфицирующим веществам, поэтому в посуде, куда помещают исследуемый материал, не должно содержаться даже следов дезинфицирующих веществ. Время от взятия материала до проведения посевов не должно превышать 3 ч. Лучше материал сразу брать в 1% пептонную воду, являющуюся средой накопления (можно использовать другие среды накопления - щелочную консервированную жидкость с морской солью и др.).

Цель исследования: выявление холерного вибриона и определение его серовара.

Материал для исследования

1. Испражнения.

2. Рвотные массы.

3. Секционный материал.

Кроме того, обязательно исследуют воду, пищевые продукты и смывы с объектов внешней среды.

Способы сбора материала

Способы сбора материала

При массовых обследованиях по эпидпоказаниям для выявления носительства можно делать групповые посевы. Материал от 4-5 обследуемых засевают в одну колбу с 100 мл 1% пептонной воды (исследование ведут как один анализ). При положительном ответе материал снова берут и засевают индивидуально.

При пересылке исследуемого материала банки с материалом плотно укладывают в металлическую посуду (бюкс, кастрюлю), прилагают сопроводительный документ с перечислением отправляемых материалов, указанием предполагаемого диагноза, времени и места взятия материала и фамилией собиравшего материал.

Основные методы исследования

1. Бактериологический.

2. Микроскопический.

3. Серологический.

Исследование проводят поэтапно. Интервалы между этапами должны быть максимально короткими. Пересевы на жидкие среды проводят через 6-8 ч, а на плотные - через 12-18 ч (поэтапное исследование требует круглосуточной работы).

Ход исследования

Этап I

Этап I

Этап II

Через 6-8 ч посевы на 1% пептонной воде вынимают из термостата. Пленку или материал с поверхности среды засевают на вторую пептонную воду и делают мазок, фиксируют, окрашивают карболовым фуксином и по Граму. Микроскопируют. Если в мазках обнаруживают сходные с холерным вибрионом подвижные бактерии, то ставят ориентировочную реакцию агглютинации с сывороткой. Для этого на обезжиренное предметное стекло наносят одну каплю О-сыворотки, разведенной в 100 раз. Контролем служит капля изотонического раствора натрия хлорида. В обе капли вносят материал из пленки и тщательно эмульгируют. При наличии в капле сыворотки агглютинации и отсутствии ее в контроле пленку засевают на щелочной агар и инкубируют в термостате.

Этап III

Через 12-14 ч вынимают посевы из термостата. Изучают рост посевов на плотной питательной среде. При наличии подозрительных колоний отбирают не менее пяти и ставят реакцию агглютинации с О-сывороткой, разведенной 1:100, при наличии положительной реакции агглютинации можно поставить ориентировочную реакцию агглютинации с типовыми сыворотками Огава и Инаба (в разведении 1:50). Наличие положительной агглютинации при типичной морфологии и культуральных свойствах дает право дать предварительный положительный ответ.

Кроме этого материал из типичных колоний (давших положительную реакцию агглютинации) высевают на полиуглеводную среду (содержит 2-3 сахара) для выделения чистой культуры, а также в бульон.

Бульон инкубируют 3-4 ч при 37° С. С молодой бульонной культурой ставят развернутую реакцию агглютинации.

Этап IV

Через 12-14 ч вынимают посевы из термостата. На полиуглеводной среде изменяется цвет столбика (расщепление сахарозы). Скошенная часть не изменяется. Полученную культуру идентифицируют.

Идентификация культуры

Идентификация культуры производится по следующим тестам.

1. Изучение морфологических свойств, подвижности висячей и раздавленной капле).

2. Изучение культуральных свойств.

3. Изучение антигенных свойств (в реакции агглютинации).

4. Изучение сахаролитических свойств.

5. Определение протеолитических свойств.

6. Определение гемолитических свойств.

7. Определение уреазной активности.

8. Изучение восстановительных свойств (реакция холера-рот).

9. Изучение диастатической активности.

10. Постановка реакции Фогеса - Проскауэра.

11. Проба на оксидазу.

12. Определение чувствительности к фагам.

13. Определение чувствительности к полимиксину.

Изучение морфологических свойств, подвижности и культуральных свойств проводят с первых этапов исследования.

Определение антигенных свойств. Ставят развернутую реакцию агглютинации с видоспецифической холерной О-сывороткой и типоспецифическими сыворотками Огава и Инаба.

Реакцию ставят в объеме 1 мл. Сыворотки разводят начиная с 1:50 до титра. К каждому разведению добавляют по 2 капли выделенной культуры, реакцию сопровождают контролем сыворотки и контролем культуры. Учитывают реакцию через 18-20 ч. Положительная реакция должна быть не менее половины титра сыворотки.

Ферментацию углеводов определяют на средах Гисса. Результаты учитывают через 6-14 ч. Расщепление глюкозы, сахарозы, маннита, мальтозы и манозы при отсутствии ферментации арабинозы является диагностическим показателем.

Протеолитические свойства определяют путем посева выделенной культуры в столбик желатина; инкубируют при 22° С 2-3 дня. Положительная реакция выражается в воронкообразном разжижении желатина.

Гемолитические свойства определяют путем добавления к 1 мл 24-часовой бульонной культуры 1 мл 1% взвеси эритроцитов барана. Контролем служит 1 мл бульона + 1 мл 1% взвеси эритроцитов. Обе пробирки инкубируют 2 ч при 37° С. Затем переносят на холод.

Учет производят через 16 ч. При положительном результате в опытной пробирке (V. eltor) эритроциты гемолизируются (лаковая кровь), в контрольной - неизмененная взвесь эритроцитов. V. cholerae гемолиза не вызывает.

Уреазную активность определяют посевом выделенной культуры на среду с мочевиной. Положительный результат характеризуется изменением желтого цвета среды в красный.

Изучение восстановительных свойств (реакция холера-рот). Холерные вибрионы восстанавливают нитраты в нитриты. При добавлении к 24-часовой культуре концентрированной серной кислоты из расчета 2-3 капли на 1 мл культуры освобождается азотистая кислота, которая, связываясь к индолом, образует новое соединение (нитрозоиндол). Среда окрашивается в рубиново-красный цвет.

Диастатическую активность определяют на среде Кодама, содержащей растворимый крахмал. Индикатором служит раствор Люголя. Холерные вибрионы расщепляют крахмал, поэтому цвет среды после прибавления раствора Люголя не изменяется.

Реакция Фогеса - Проскауэра. Исследуемую культуру засевают в среду Кларка. Посев ставят в термостат. После 2-3 дней инкубации посевы вынимают из термостата и к 1 мл выросшей культуры добавляют 0,6 мл α-нафтола и 0,2 мл 40% раствора гидроксида натрия. Положительная реакция характеризуется появлением красного окрашивания (за счет ацетилметилкарбинола).

Проба на оксидазу. На поверхность 18-часовой агаровой культуры наносят каплю 1% водного раствора параамино-диметиланилина (гидрохлорида или оксалата), добавляют каплю 1% спиртового раствора α-нафтола. При положительной реакции на оксидазу через 2-3 мин культура окрашивается в ярко-синий цвет.

Определение чувствительности к фагам. Исследуемую культуру засевают на щелочной агар и наносят бактериофаг С Мукерджи IV типа и бактериофаг Эль-Тор. Реакцию учитывают через 14-16 ч (см. главу 8; табл. 40).

Таблица 40. Чувствительность к холерным фагам

Примечание. + лизируется; - не лизируется.

Определение чувствительности к полимиксину. В расплавленный и остуженный агар добавляют полимиксин (из расчета 50 ед. в 1 мл среды). Среду размешивают и разливают в чашки Петри. На застывшую среду петлей засевают выделенную культуру и инкубируют в термостате. Через 8-10 ч вынимают посевы из термостата. Холерные вибрионы не растут в присутствии полимиксина. Вибрионы Эль-Тор вырастают (табл. 41).

Таблица 41. Дифференциальные свойства V. cholerae, V. eltor и нехолерных вибрионов