Микробиологического исследования при риккетсиозных инфекциях
План
1. Общая характеристика методы культивированиия риккетсий.
2. Классификация риккетсиозов.
3. Эпидемический и эндемический сыпной тиф.
4. Особенности возбудителей, механизм заражения.
Иммунитет.
РИККЕТСИИ
Общая характеристика и классификация.
Риккетсии (Rickettsia) включены в порядок Rikettsiales,семейство Rickettsiaceae, род Rickettsia.
Общая характеристика.
В соответствии с систематикой Берджи («Определить бактерий», 1974) риккетсии занимают промежуточное положение между бактериями и вирусами (0,3-04, мкм). По морфологическим свойствам и химическому составу они похожи на бактерии, а по своим физиологическим свойствам они приближаются к вирусам.
Все риккетсии являются облигатными внутриклеточными паразитами, т.е. живут и размножаются (как и вирусы), только в клетках (цитоплазме и ядре) тканей животных, человека и переносчиков. И не растут на искусственных питательных средах.
Это полиморфные микроорганизмы, имеющие следующие формы:
1. кокковидные – мелкие овоидные, d = 0,5 мкм, часто в виде диплококков;
2. палочковидные – изогнутые короткие, тонкие палочки 1-1,5 мкм с зернами на концах, или длинные 3-4 мкм;
3. нитевидные (мицелярные) – 10-40 мкм, изогнутые, иногда многозернистые нити.
Не образуют спор, капсул, неподвижны!
Хорошо окрашиваются по Романовскому-Гимзе, Цилю-Нильсену, грамотрицательны (грам -).
Электронной микроскопией и цитохимическими исследованиями у риккетсий установлено наличие внутренней и наружной оболочки, выполняющей функции стенки состоящей из 3-ех слоев. В цитоплазме риккетсий обнаружены, гранулы типа рибосом (20-70) и вакуолеобразные структуры (6-8 нм в диаметре).
Риккетсии размножаются путем деления кокковидных и палочковидных форм с образованием гомогенных популяций соответствующего типа, а также в результате дробления нитевидных форм с последующим развитием кокковидных и палочковидных образований.
Большая часть риккетсий относится к безвредным микроорганизмам. Около 50 различных видов риккетсий найдено в кишечнике и слюнных железах тлей, клопов, клещей.
Патогенные риккетсии поражают различные виды животных и человека; заболевания, вызываемые риккетсиями, носят название риккетсиозов.
Классификация риккетсий и риккетсиозов:
| Группа | Возбудители | Особенности паразитирования | Переносчики возбудителей | Источник инфекции | Наименование заболевания |
| Сыпные тифы | R.prowazekii R.typhi | Размножаются в цитоплазме и эн-дотелии сосудов Там же | Платяная и головная вши Крысиные блохи и вши | Больной человек Крысы, мыши | Эпидемический сыпной тиф Эндемический сыпной тиф |
| Клещевые пятнистые лихорадки | R.conorii R.sibirica R.akari | Размножаются в цитоплазме и ядре Там же Там же | Собачий клещ Иксодовые клещи Гамазовые клещи | Южный собачий клещ Грызуны (мыши, суслики) Домовая мышь, черная и серая крысы | Марсельская лихорадка Североазиатский (сибирский) риккетсиоз Везикулезный (осповидный) риккетсиоз |
| Риккетсиозы цуцуга-муши | R.tsutsuga-mushi | Размножаются в цитоплазме | Краснотел-ковые клещи | Грызуны, сум-чатые, насекомые | Лихорадка цуцу-гамуши |
| Пароксизма-мальный риккетсиоз | Rochalimae quintana | Внеклеточный паразитизм | Платяная вошь | Больной человек и носитель | Волынская (пяти-дневная) лихорад-ка |
| Ку-риккет-сиоз | Coxiella burnetii | Размножаются в вакуолях и цито-плазме макрофагов | Иксодовые и гамазовые клещи | Многие виды диких и домаш-них животных | Ку-лихорадка (пневмориккет-сиоз) |
Возбудитель сыпного тифа
В 1909-1910 гг. Г. Риккетс и Р. Уайллер нашли в крови больных мексиканским сыпным тифом и в зараженных вшах неподвижные мелкие биполярные микроорганизмы. В 1913 г. Чешский ученый С. Провачек обнаружил в плазме и лейкоцитах людей, больных сыпным тифом, овальные и продолговатые тельца, окрашенные по Романовскому-Гимзе. В 1916 г. Г. Х. Роша-Лима на основании своих многолетних исследований пришел к выводу, что сыпной тиф вызывают мелкие полиморфные микроорганизмы, обнаруживающиеся в крови больных и в кишечнике зараженных вшей. В честь первооткрывателей он их назвал риккетсиями Провачека.
Морфология:
Риккетсии Провачека – гантелевидные микроорганизмы, описание - смотри общую характеристику. Средние размеры их 0,3-0,6 мкм. Они хорошо окрашиваются феноловым фуксином в красный цвет. В электронном микроскопе у них выявлена микрокапсула (толщиной 10-12нм).
Культивирование:
Хорошо размножаются при t 25°С в желточном мешке куриного эмбриона.
Используют и другие методы:
1. В куриных эмбрионах по Коксу: материал содержащий риккетсии, вводят в полость желточного мешка → яйца в термостат при 36-37°С на 6-7 дней;
2. Интраназально заражают белых мышей, в легких которых накапливаются риккетсии;
3. По методу Вейгля и Мосинга – платяных вшей заражают взвесью риккетсий путем введения в кишку через анальное отверстие с помощью специальных капилляров.
4. А. В. Пшеничков и Б. И. Райхер – метод культивирования риккетсий на личинках вшей, которых кормят через мембрану кожи трупа дефибринированной кровью.
5. И можно, как вирусы, путем заражения тканевых культур (об этом методе более подробно мы поговорим на следующей лекции).
Методы культивирования риккетсий используют при изготовлении сыпнотифозной вакцины и для получения антигенов для серодиагностики риккетсиозов.
Токсинообразование:термолабильный токсин (эндотоксин), который разрушается при 66°С.
Антигенная структура:
2 антигена:
I Аг:термолабильный, спефический для риккетсий Провачека, корпускулярный, поверхностный растворимый, не обладает видовой специфичностью.
II Аг:термостабильный, общий для риккетсий Провачека и крысиного сыпного тифа. Общий с риккетсиями полисахаридный гаптен имеет протей – ( Proteus OXI9, OX2, OXK, OXL). Этот Аг липидополисахаридопротеиновый комплекс.
Резистентность:
В высушенных и неповрежденных вшах риккетсии сохраняются до 30 суток, в сухих фекалиях вшей – до 6 суток. От t 50°C гибнут через 15' и при 100°C – через ½ минуты. Губительное действие на них оказывают все применяемые дезинфицирующие средства.
Патогенность для животных:
Восприимчивы обезьяны, морские свинки, белые мыши.
Эпидемиология:
Сыпной тиф – антропонозное заболевание, источником его всегда является больной человек. Носительства нет. Восприимчивость к заболеванию всеобщая. Дети младшего возраста переносят тиф легче, чем пожилые люди. Характерна сезонность заболевания: февраль-май. Развитию болезни способствуют скученность, антисанитарные условия.
Патогенез:
В 1876 г. О. О. Мочутковский опытами на себе впервые доказал заразность крови людей, больных сыпным тифом. Он высказал предположение, что сыпной тиф передают кровососущие насекомые. В 1909 г. Ш. Николь и соавторами подтвердили это положение на обезьянах и установили передачу сыпного тифа через платяную вошь(Pediculus humanus).
Источник болезни – больной человек, переносчик – платяная вошь. Насосавшись крови сыпнотифозного больного, платяная вошь на 3-10е, чаще 4-5е сутки становится заразной. Риккетсии развиваются при 30°C в кишечнике вшей (в клетках эпителия слизистой оболочки кишечника). В результате накопления риккетсий клетки разрушаются, и возбудители вместе с испражнениями попадают на кожу, платье и т.д. Заражение сыпным тифом происходит не через укус вшей, а при втирании риккетсий, которые выделяются при дефекации на кожу и слизистые оболочки.
Риккетсии Провачека вызывают у людей сыпной тиф, который протекает в виде лихорадочного состояния с розеолезно-петехиальной сыпью. Сыпной тиф относится к кровяным инфекциям. Возбудитель в период лихорадки находится в лейкоцитах, эндотелии сосудов кожи, мозга и других органов. Множественный тромбоз артериальной системы приводит к нарушению питания ткани, гибели клеток, особенно ЦНС. На 1 см2 поверхности мозга насчитывается несколько тысяч гранулем.
Патологический процесс обусловлен паразитированием риккетсий Провачека в эндотелии мелких кровеносных сосудов и образованием в них специфических гранулем.
Инкубационный период 12-14 дней, с колебаниями от 1 до 3 недель.
Осложнения при сыпном тифе встречаются редко. Иногда возможны гипостатическая пневмония, пролежни, отиты.
Иммунитет: постинфекционный – прочный!
В последние годы количество повторных случаев возросло. Повторные случаи сыпного тифа представляют собой эндогенные рецидивы первичного заболевания. Повторные случаи сыпного тифа называют болезнью Брилля-Цинссера. Рецидивы наступают после различных неблагоприятных воздействий (заболевания, хирургическое вмешательство, переохлаждение, психические и физические травмы, переутомление, голод), на организм, который в течение длительного времени являлся носителем риккетсий в покоящихся формах в состоянии персистирования.
Болезнь Брилля-Цинссера характеризуется более легким клиническим течением с сохранением наиболее типичных признаков сыпного тифа при отсутствии вшивости.
Лабораторная диагностика:
Материалом для выделения возбудителя при всех видах риккетсиозов служит кровь, взятая у больного из вены в возможно раннем периоде лихорадки.
Обычно используют цитратную кровь или взвесь из растертого сгустка свернувшейся крови. Кроме того, материалом могут служить переносчики, органы зараженных животных.
Применяются:
1. Серологический – основной метод;
2. Биологический;
3. Микробиологический;
4. Микроскопический.
Алгоритм
микробиологического исследования при риккетсиозных инфекциях
I этап:
Серодиагностика → ответ:
§ Реакция агглютинации риккетсий (РАР);
§ РСК;
§ РПГА;
§ ИФА;
§ РН риккетсий сывороткой больного с последующей биопробой.
Биопроба: заражение самцов морских свинок в/брюшинно или интрацеребрально.
Микробиологическая:
I этап:
а) Введение материала в желточный мешок куриного эмбриона;
б) Заражение тканевых культур.
II этап:
1. Вскрытие животных → препараты из органов, окраска по Здрадовскому, ответ.
2. Препараты из зараженных эмбрионов и тканевых культур, окраска по Здрадовскому и иммунофлюоресцентный метод → ответ.
Серодиагностика:
РАР– в пробирках по 0,5 мл объем: 0,25 мл разведения сыворотки + 0,25 мл соответствующих антигенов, → +37°C 18 часов → учет результата, не встряхивая пробирки. Положительной считается реакция не менее, чем на ++ (незначительное просветление, зернистый осадок) в разведениях 1:40 – 1:80.
РСК– по общепринятой методике; реакция считается положительной при задержке гемолиза не менее чем ++. Условно-диагностический титр 1:160 и выше.
РПГА– с разведениями сывороток от 1:250 до 1:64000 по обычной схеме. Условно-диагностический титр 1:250.
Серологическое дифференцирование первичного (эпидемического) и повторного сыпного тифа (болезнь Брилля):
При 1-ом и повторном сыпном тифе формируются качественно различные иммуноглобулины (Ig): при первичном – Ig М (19 S), при повторном – Ig G (7 S). Дифференцирование Ig М и Ig G антител основано на их различной чувствительности к действию редуцирующих веществ, содержащих свободные сульфгидридные группы (2-меркаптоэтанол, цистеин и др.) Эти вещества вызывают разрыв дисульфидных связей в молекулах
Ig М и их распад на субъединицы, лишенные активности антител. Ig G при этом не изменяются. Параллельно ставят РСК с испытуемой исходной сывороткой и обработанной 2-меркаптоэтанолом или цистеином (см. табл. № 95). В случае первичного сыпного тифа наблюдается снижение титра антител в обработанной сыворотке не менее, чем в 4 раза по сравнению с необработанной исходной сывороткой. При повторном сыпном тифе титр антител в обеих сыворотках должен быть одинаковым (допускается снижение титра не более чем в 2 раза).
Лечение:
Антибиотики. Чаще тетрациклины, левомицетин, рифампицин.
В последние годы летальность совсем не регистрировалась.
Профилактика:
· Ранняя диагностика, изоляция и госпитализация больных.
· Санитарная обработка в очаге (дезинсекция).
· Учет и наблюдение за контактировавшими с больными.
· Осмотры на педикулез, санпросвет работа среди населения.
· Вакцинация сухой живой сыпнотифозной вакциной, изготовленной из авирулентного штамма Е. В связи со значительным улучшением санитарного состояния населения иммунизации подлежат только отдельные контингенты.
Благодаря значительному улучшению условий жизни людей и проведению профилактических мероприятий эпидемический сыпной тиф на большей части территории Беларуси ликвидирован. Сухая живая комбинированная сыпнотифозная вакцина Е(ЖКСВ – Е) – смесь живой яичной культуры риккетсий Провачека вакцинного штамм Е, выращенной в курином эмбрионе, с растворимым антигеном вирулентного штамма риккетсий Провачека. Применяется для активной иммунизации против сыпного тифа. Есть химическая сыпнотифозная вакцина.
Риккетсии Музера.
Возбудитель открыт в 1928 г. Х. Музером. По своим биологическим свойствам во многом сходен с риккетсиями Провачека.
Морфология.
Менее полиморфны, чем R.prowazekii. Это - мелкие палочки и кокковидные клетки длиной 0,7-1,3 мкм и шириной 0,35-0,6 мкм, редко образуют нитевидные клетки. Грам -, по Здрадовскому окрашиваются в красный цвет.
Культуральные свойства.
Хорошо размножаются в курином эмбрионе и некоторых культурах клеток, образуя, как и риккетсии Провачека бляшки, t° optim 35°C.
Токсикообразование:эндотоксин.
Антигены:
1) Термостабильный Аг, общий с риккетсиями Провачека;
2) Термолабильный Аг, видоспецифический, он позволяет дифференцировать от других видов риккетсий.
Этиопатогенез.
Эндемический, или крысиный, сыпной тиф – остролихорадочная зоонозная инфекция, встречающаяся среди крыс, серых и черных мышей, которые и являются источником инфекции. Передается их паразитами: крысиными блохами, способными нападать на человека, крысиными вшами, не нападающими на людей, и гамазовыми клещами. Эктопаразиты заражаются при кровососании, риккетсии размножаются у них в кишечнике и выделяются с фекалиями. Циркуляция риккетсий происходит по цепи крыса или мышь → крысиная блоха или вошь → крыса или мышь.
Человек заражается:
Ø путем втирания в кожу при расчесах фекалий блох;
Ø аэрогенно при попадании фекалий на слизистые оболочки верхних
дыхательных путей;
Ø алиментарным путем при загрязнении пищевых продуктов мочой грызунов.
Эндемический сыпной тиф распространяется повсеместно, особенно в зонах большого количества крыс (морские порты), а так же в тех местах, где имеются случаи эпидемического сыпного тифа. Патогенез сходен с эпидемическим сыпным тифом.
Постинфекционный иммунитет стойкий и продолжительный (пожизненный), при этом создается невосприимчивость и к эпидемическому сыпному тифу.
Лабораторная диагностика:
1) Серодиагностика – РАР и РСК со специфическими антигенами, позволяет ставить диагноз крысиного сыпного тифа и дифференцировать его от эпидемического сыпного тифа;
2) Биопроба – заражение самцов морских свинок (у них развивается лихорадка и периорхит при эндемическом, и только лихорадка при эпидемическом сыпном тифе).
Специфическая терапия – антибиотики тетрациклинового ряда, средств специфической профилактики нет.
Коксиеллы Бернета.
Coxiella burnetii – относится к роду Coxiella, семейству Rickettsiaceae. Являются возбудителем Ку-лихорадки (от англ. query – неясный, неопределенный). Болезнь впервые была описана в 19 веке в Австралии, а затем в других странах. Возбудителя впервые идентифицировали как риккетсии Ф. Бернет и М. Фриман.
Морфология:
Грам - , неподвижные, мелкие кокковидные или палочковидные образования размером 0,25 х 1,5 мкм. По Романовскому-Гимзе → в иссиня-пурпурный цвет, по Здрадовскому → в красный.
Культивирование:
Облигатные внутриклеточные паразиты с автономным, в отличие от вирусов обменом веществ. Культивируются в желточных мешках куриного эмбриона или в культуре клеток (куриных и мышиных фибробластов), размножаясь почти исключительно в вакуолях.
Резистентность:
Довольно устойчивы к воздействию физических и химических факторов. До 90°C выдерживают больше часа. Длительно сохраняются в окружающей среде.
Антигены:
Два Аг – Ι фазы и ΙΙ фазы. Аг Ι фазы является поверхностным полисахаридным, Аг ΙΙ фазы глубоко в клетке, его химическая природа неизвестна. Способность к образованию токсина у риккетсий Бернета пока не доказана.
Этиопатогенез:
Ку-лихорадка встречается повсеместно, не зарегистрирована только в Финляндии, Швеции, Норвегии, Дании, некоторых странах Западной Африки и Южной Америки). Ку-лихорадка – зоонозная инфекционная болезнь, характеризующаяся полиморфной клинической картиной с преимущественным поражением легких. Паразитирование C. burnetii выявлено у многих видов млекопитающих, птиц, членистоногих. Установлено носительство их у 92 видов диких млекопитающих, 72 видов птиц, 73 видов клещей. Особенно опасны домашние животные (лошади, рогатый скот, собаки) и грызуны. В природных очагах передача возбудителя происходит трансмиссивным путем (клещи).В сельскохозяйственных очагах источником возбудителя является крупный и мелкий рогатый скот, лошади и верблюды. Передача возбудителей происходит воздушно-пылевым (при обработке шерсти, кожи зараженных животных) и пищевым(при употреблении молока и молочных продуктов), контактным и трансмиссивным путями.
Заражение здорового человека от больного не наблюдается.! Возбудитель → в кровь (виремия) → поражает многие органы и ткани, чаще легкие. Протекает как лихорадочное заболевание, с развитием аллергии.
Постинфекционный иммунитет – прочный и длительный, повторно редко.
Лабораторная диагностика:
Ø Биопроба.
Ø Микробиологический.
Ø Серодиагностика.
Ø Кожно-аллергический.
Материал:кровь, мокрота, моча.
Морских свинок заражают материалом от больного → из селезенки морских свинок возбудителей выделяют путем культивирования на курином эмбрионе. Для серодиагностики применяют РАР, РСК, разработан ИФА.
Для диагноза может быть использована кожно-аллергическая проба с Аг.
Специфическая терапия: антибиотики тетрациклинового ряда и левомицетин.
Специфическая профилактика: П. Ф. Здродовский и В. А. Гениг разработали эффективную живую вакцину из штамма М-44 для профилактики Ку-лихорадки.