Реакция пассивной агглютинации (РПА)

Иод РПА понимают реакцию, а которой АТ-а взаимодействуют с высокодисперсными АГ (гаптенами), предварительно адсорбированными на корпускулярных носителях, которые при этом склеиваются.

В качестве корпускулярных носителей применяют эритроциты животных, частицы латекса (полимерные микрошарики), бентонита, сефарозы, клетки St. Aureus (штам, содержащий протеин А).

Различают 3 -гипа РПА:

1) различные варианты РПГА (реакции пассивной (емаг-. глютинации);

2) Р. коагглютинации;

3) Р латексаагглюгинации.

1. РПГА — реакция пассивной гемагглютинации.

В основе лежит агглютинация сенсибилизированных эритроцитов РПГА, как правило подразумевает использование эритроцитов, сенсибилизированных АТ-ми.

Эритроциты используются нативные и фиксированные (формальдегидом, глутаровым альдегидом, хлоридом хрома и др).

Ингредиенты реакции РПГА:

1) растворимый (высокодисперсный) АГ (белки, полисахариды и др );

2) эритроциты (носитель);

3) АТ (испытуемая сыворотка или диагностическая иммунная сыворотка; обычно разводят в соотношении от 1:10 до 1:20480);

4) изотонический раствор хлорида натрия.

Реакцию инкубируют сначала при 37 ‘С з течение 2 часов, затем при комнатной температуре в течение 18-24 часов.

При положительной реакции, в результате образования комплекса (АГ-АТ) на поверхности эритроцитов, последние склеиваются и равномерно покрывают все дно пробирки или всю лунку пластинки в виде зонтика с неровными краями. При отрицательной реакции скопление эритроцитов имеет вид меленького диска с ровными краями («пуговки»).

Ставят контроли специфичности реакции с иммунной антисывороткой (положительная реакция) и нормальной сывороткой (отрицательная реакция).

Контролем спонтанной агглютинации эритроцитов служат реакции со взвесью сенсибилизированных и не сенсибилизированных эритроцитов в разведенной нормальной сыворотке.

Недостатки:

1) трудность стандартизации эритроцитов при изготовлении диагностикумов;

2) небольшой срок хранения диагностикумов, Достоинства: простота и дешевизна.

Эти СР широко применяются. Например, состояние иммунитета против дифтерии у детей и подростков проверяют с помощью РПГА с дифтерийным эригроцитарным диагностикумом (анатоксинным). Неиммунными считаются лица с титром антитоксина менее 0,03 МЕ/мл (1:20).

Необходимые ингредиенты:

1. испытуемая сыворотка;

2. диагностикум дифтерийный эритроцитарный;

3. физиологический раствор;

4. противодифтерийная контрольная сыворотка с активностью ЮМЕ/мл:

5. полистироловые пластины (при их отсутствии — пробирки). Испытуемую сыворотку разводят физ. раствором от 1:10 до 1:20480 в 12 лунках. Реакция ставится в объеме 0,8 мл. Вносят по 1 капле диагностикума в каждую лунку.

Противодифтерийную контрольную сыворотку (с активностью 10 МЕ/мл) разводят от 1:10 до 1:20480 и вносят также по 1 капле диагностикума.

Оставляют при комнатной температуре на 3 часа (максимум на 15-20 часов) и читают реакцию.

Учет реакции проводят по степени агглютинации эритроцитов, которую оценивают по 4-кратной системе:

+ + + + агглютинировавшие эритроциты ровным слоем выстилают все дно лунки, образуя по форме перевернутый купол, края купола иногда заворачиваются;

+ + + в верхней части агглютината отмечается более широкое плотное кольцо;

+ + в верхней части агглютината более широкое плотное кольцо из эритроцитов, но меньшее по диаметру;

+ — на дне лунки образуется широкое плотное кольцо из эритроцитов; но меньшее по диаметру;

- — на дне лунки имеется плотный диск или плотное широкое кольцо, но уменьшенного диаметра, по сравнению с реакцией в +.

Титром антитоксина в исследуемом материале считают последнее максимальное разведение, которое еще вызывает агглютинацию титра антитоксина испытуемой сыворотки.

Расчет активности испытуемой сыворотки производят по формуле:

Х = (10А)/В, где:

X — активность испытуемой сыворотки в МЕ/мл;

10 — титр контрольной сыворотки в МЕ/мл;

А — максимальное разведение испытуемой сыворотки с положительным результатом;

В — максимальное разведение контрольной сыворотки с положительным результатом.

2. Реакция коагглютинации, латексагглютинации.

Диагностикум содержит стафилококки для коагглютинации и частицы латекса для латексреакции, на поверхности которых находятся АТ-ла

В случае с фиксированными клетками стафилококка связывание АТ происходит за счет взаимодействия Рс-участками 1дС с молекулами протеина А. При получении латексных диаг-ностикумов используют химическое связывание АТ или АГ с полимерной основой частиц или взаимодействие, основанное на гидрофобных силах.

Достоинства: простота постановки.

Недостаток: возможность неспецифической агглютинации.

Реакция преципитации

Преципитация и агглютинация — это довольно сходные реакции, которые различаются главным образом на основании физических свойств АГ. В первом случае он представлен в растворимой, во втором — в корпускулярной формах. В основе РП лежит образование преципитата в процессе реакции АГ-АТ.

РП высоко специфична и чувствительна.

Ингредиенты реакции:

1. растворимый АГ или гаптен (преципититоген);

2. АТ — преципитины {иммунная преципитирующая сыворотка; получают иммунизацией кроликов соответствующими растворами АГ-ми);

3. изотонический раствор хлорида натрия или агаровый гель.

Методы постановки РП:

1) РП в растворах — р. кольцепреципитации;

2) РП в геле.

Реакцию кольцепреципитации ставят в узких преципитационных пробирках, в которые разливают преципитирующие сыворотки. Затем наливают раствор преципитиногена. При положительной реакции на границе соприкосновения ингредиентов появляется мутное кольцо преципитации.

Примером такого способа постановки РП является реакция термопреципитации по Асколи, применяемая для обнаружения термостабильного гаптена возбудителя сибирской язвы, извлекаемый из органов животных, кожи, шерсти экстракцией при кипячении.

Одна из разновидностей РП в геле (реакция Оухтерлони) позволяет определять токсигенность дифтерийной палочки с помощью антитоксической сыворотки. В чашку Петри с питательной средой помещают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной антитоксической противодифтерийной сывороткой и засевают исследуемыми культурами в виде штрихов, перпендикулярных к полоске бумаги. Инкубируют при 37 ПС в течение суток. При наличии токсигенной культуры в месте взаимодействия токсина с антитоксином образуются линии преципитации.

Реакция преципитации в геле носит название иммунодиф-фузии. Часто форезом в геле — иммуноэлектрофорез. Принцип метода: исследуемый антиген фракционируют электрофорети-чески. полученные фракции анализируют методом двойной диффузии при помощи антисыворотки.