Лабораторная диагностика туберкулеза

Возбудители Micobacterium tuberculosis (92%), M. bovis (5%), M. africanus(3%) сем. Micobacteriacae, порядок Actinomycetalis, род Mycobacterium. Полиморфизм. Длинные, тонкие (М. tuberculosis, М. africanum) или более короткие толстые (М. bovis) прямые или слегка изогнутые палочки с зернистой цитоплазмой, содержащей от 2 до 12 зерен различной величины, состоящих из липидов или метафосфатов и играющих важную роль в клеточном метаболизме бактерий. Грамположительны, неподвижны, спор не образуют. В наружном слое миколовые кислоты.Срогие аэробы. Размножаются крайне медленно, требовательны к питательным средам, глицеринозависимые. Им нужны факторы роста: витамины группы В,аспаргиновая и глютаминовая аминокислоты. Стимулятор роста лецитин. Для подавления роста сопут. микрофлоры малахитовый зеленый и антибиотики,температура 37—38.

Клинические формы туберкулеза Туберкулез ( лат. tuberculum — бугорок) — первично-хроническое заболевание человека и животных, сопровождающеся поражением различных органов и систем (органов дыхания, лимфатических узлов, кишечника, костей и суставов, глаз, кожи,почек и мочевыводящих путей, половых органов, центральной нервной системы) С образованием гранулем (от лат. granulum — зернышко и греч. oma —опухоль), воспалительная реакция тканей, имеющую вид узелка или бугорка. Основной фактор патогнности липиды.бронированные микробы поражают макрофаги. Они обладают способностью подавлять фагоцитоз. Инкубационный период от неск нед до 1 года и более (до 40 лет).

Исследуемый материал мокрота, промывные воды бронхов и желудка, плевральная и цереброспинальная жидкости, моча, меструальная кровь, асиитическая жидкость, ткани и органы, взятые на исследование во время операции или биопсии.

Методы обогащения: Флотация – к исследуемому материалу добавляют ксилол или бензол, микобактерии, содержащие до 30% липидов концентрируются на поверхности. Гомогенизацияобработкой щелочами, муколитиками ,центрифугирование и микроскопия осадка.

Бактериоскопический метод: окраска по Цилю-Нильсену и люминисцентная микроскопия.

M. tuberculosis в мокроте Окраска по Цилю-Нельсену. Увеличение х1000

M. tuberculosis Мазок мокроты в люминисцентном микроскопе. Окраска акридиновым оранжевым Увеличение х1000

Бактериологический методМокрота ® Гомогенизация и обработка 5% серной кислотой ® Посев на среду Левенштейна-Йенсена ® Инкубация 2-4 недели при 37⁰С ® Учет результатов (культуральные, тинкториальные и морфологические свойства) ® Определение чувствительности к антибиотикам методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна- Йенсена:

Питательные среды и условия культивирования среды, содержащих яичный желток: Левенштена-Йенсена . Финна и Огавы , а также жидкие среды Мидлбрук 7Н9 бульон и бульон Сулла.

Характер и скорость роста Растут медленно, первые признаки роста на 21 день, в виде светло кремового, белого или бледно-желтого чешуйчатого налета с неровными краями (R-форма колоний), бородавчатый вид, напоминая цветную капусту. На жидких средах через 5—7 дней дает рост в виде толстой твердой сухой бугристо-морщинистой пленки кремового цвета (цвет слоновой кости).

Определение чувствительности к антибиотикам методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна - Йенсена:

Концентрация препарата, мкг/мл				Контроль роста культуры
Стрептомицин	+	+	-	+
ПАСК	+	+	+	+

Примечание: (+) - наличие роста; (-) - отсутствие роста.

Вывод: Суточная доза стрептомицина 15 мкг/кг, ПАСК- Т 1 мкг/кг поэтому M. tuberculosis устойчив к парааминосалициловой кислоте (МИК >100 мкг/мл)., но чувствителен к стрептомицину (МИК 10 мкг/мл).

Общая продолжительность исследования 1,5-2 мес. или 60 дней.

Микрокультура микобактерий туберкулеза с корд-фактором ( trehalose 6,6-dimycolate высоко вирулентен) Окраска по Цилю-Нельсену х630.

Ускоренное исследование (принцип метода)BD BACTEC™ MGIT™ 960 - автоматизированный комплекс: детекции микобактерии в жидкой среде Мидлбрук 7Н9 3-15 дней, определение чувствительности к АБП 1 ряда (стрептомицин, изониазид, рифампицин, этамбутол) 7-9 дней; высеваемость 94%; Пробирка MGIT с флуоресцентным индикатором роста на дне, погашенным высокими концентрациями О². Размножаясь микобактерии поглощают кислород, флюоресцентный компонент начинает светиться при УФ облучении. BACTEC выявляет 100 000 бактерий в 1 мл .Средняя продолжительность 21 день ПЦР и гибридизации ДНК с применением микробиочипов.